喷射流回路反应器中液体酶催化制备生物柴油

引言

生物柴油是一种绿色清洁的生物燃料，通常以动植物油脂为原料，用碱性催化剂催化与短链醇（甲醇或乙醇）进行酯交换反应得到。但碱催化对反应原料品质要求高，不含有游离脂肪酸和水。地沟油由于自身含有较高游离酸和水不能直接用碱催化生产工艺。与之相比，酶催化具有绿色、低能耗和容易分离等优点，酶能在有水的环境中发生酯化和酯交换反应，是以地沟油为原料生产生物柴油的更适宜方法。酶又分为固定化酶和液体酶，固定化酶由于制备工艺复杂，价格昂贵不利于工业生产，液体酶可以有效控制生产成本，更适宜工业化生产。

喷射流回路反应器又叫做喷射环流反应器，在相对低能耗下具有优异的混合和传质性能，提高反应效率，在多相反应体系中的应用具有良好的表现。广泛应用于氢化反应、污水处理、微生物发酵等领域。目前，利用喷射流回路反应器进行液体脂肪酶催化制备生物柴油的研究鲜有报道。

本研究以地沟油、甲醇为原料，国产液体脂肪酶为催化剂，使用喷射流回路反应器制备生物柴油，考察了醇油比、加酶量、加水量、反应时间、反应温度对生物柴油产率的影响，为使用喷射流回路反应器进行酶法生产生物柴油的工业化生产提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

液体脂肪酶（假丝酵母，E.C 3.1.1.3，酶活力 100000 u/mL ）青岛蔚蓝生物技术公司提供、地沟油（唐河生物科技有限公司提供）、月桂酸甲酯（GC）、正己烷（GC）、无水甲醇、石油醚、无水乙醇、无水硫酸钠、氢氧化钠等均为分析纯。

C2010-PLUS气相色谱仪（日本岛津）、喷射流回路反应器DN-1（江苏七禾机械设备有限公司）、高速台式离心机（上海飞鸽TGL-16）

1.2 实验方法

1.2.1 生物柴油的制备

将500g地沟油（酸值127.12mgKOH/g）投入反应釜中，打开循环泵和冷凝系统，待反应系统内达到预设温度且温度稳定后，利用柱塞泵将一定量的液体脂肪酶溶液（10ml/min）打入到回路反应器的外循环管路中，酶（液）进完后用进料泵将甲醇以2ml/min的速度打入到外循环管路中反应一定时间。定时取样，取样品上层液体GC分析。

1.2.2地沟油理化性质的测定

地沟油的含水量、酸值、碘值、环氧值、参照国标测定。酸值：127.12 mgKOH/g；碘值：87.4gI2 /100 g；含水量：1.35%；环氧值: 1.81mol/100g；

1.2.3脂肪酸组成的测定

对地沟油进行甲酯化，离心得上层清液进行气相色谱分析

气相色谱仪型号：GC2010-PLUS；色谱柱型号：DB-1HT 毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.1 μm)；进样口温度：250℃；检测器温度：300℃；载气：N2；载气流速：1.2 mL/min；氢气：40 ml/min；空气：400 ml/min；进样量：1 μL；

柱箱升温程序：柱箱初温100℃，保留3min,然后以15℃/min升至220℃并保留10min。

脂肪酸出峰顺序为：棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸，使用面积归一法

分析各脂肪酸相对含量（棕榈酸25.85%；硬脂酸7.4%；油酸32.1%；亚油酸31.3%；亚麻酸3.35%）。

1.3 生物柴油产率的测定

生物柴油产率的计算选择采用气相色谱法，以月桂酸甲酯作为内标物确定样品中生物柴油的含量。

以月桂酸甲酯作为内标物，配制了不同质量配比的生物柴油标样和内标物的混合溶液（4:1，2:1，1:1，1:2，1:4），通过气相色谱仪检测得出峰面积比，建立峰面积比与质量比之间的关系。

此标准曲线的决定系数（R²）为0.9929，说明拟合精度较高，数据精度较为准确。通过拟合公式，我们成功建立了峰面积比与质量比之间的关系，便于后续生物柴油产率计算

式中m为测试样品中的生物柴油质量；m_ML为内标物的质量；A 为生物柴油的峰面积；A_ML 为内标物的峰面积。

生物柴油产率计算

将生物柴油与内标物以一定比例混合，通入气相色谱仪检测峰面积，分析得到生物柴油的质量。在随后的生物柴油产率计算过程中，为了计算方便，本文规定：反应的原料油与生成的生物柴油质量相同。即忽略各种差异，不考虑其他物质的生成。因此，生物柴油产率经上式可得                

式中X为生物柴油的产率;m为生物柴油产物质量;M为反应原料油的质量; 中ΣA 为所有脂肪酸甲酯峰面积之和；m_ML为内标物的质量；A_ML 为内标物的峰面积。

结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 醇油比的影响

液体脂肪酶催化地沟油与甲醇的酯交换反应属于可逆反应，甲醇含量的增加可以为反应提供更多的酰基受体，促进酯交换反应向正向进行。随着醇油摩尔比从3:1增大到6:1，生物柴油的产率也从73.63%增加到95.29%。当醇油比提高至7:1时，生物柴油的产率却从95.29%下降到91.53%，这是因为甲醇对液体脂肪酶有一定的毒性，反应体系中过量的甲醇会导致液体脂肪酶结构发生变化，变性失活，降低液体脂肪酶的催化活性。最合适的醇油摩尔比是6:1,对比传统碱催化工艺所需要消耗的10:1甚至更高的醇油比,本工艺具有较高的甲醇利用率，降低了生产成本，减少了原料浪费。采用柱塞泵打入甲醇，也减弱了甲醇毒性对于液体脂肪酶的活性抑制作用，同时提高了甲醇的转化率。

2.1.2 反应时间的影响

随着反应时间的增加，生物柴油产率呈现出先增大后减小的趋势，在反应时间为3h时，生物柴油最大产率为95.24%。反应在前两个小时内生物柴油产率增长较快，在第三个小时达到反应平衡后生物柴油产率逐渐降低，因为酯交换反应是一个可逆反应，因此在达到反应平衡后，生物柴油含量增大，逆反应速度大于正反应速度，反应向逆反应方向移动，导致生物柴油转化率下降，因此，综合考虑，选择反应时间为3h作为最适合的反应时间。

经喷射流回路反应器强化后，反应时间降低至3h，对比恒温水浴摇床和机械搅拌的24h甚至36h,采用本装置的反应时间仅需3h,反应效率提升很大，有效减少能源消耗，提高资源利用率。

2.1.3 加水量的影响

随着体系中水含量的增加（5%-10%），生物柴油的产率从91.19%增大到94.38%，当继续提高体系中水含量时，生物柴油的产率反呈现下降的趋势，从94.38%降低到88.28%。对于液体脂肪酶催化的酯交换反应来说，水的存在是必需的，因为醇油两相是互不相容的，适量水的加入可以形成液体脂肪酶-水-甲醇活性液滴，有效增大酶与地沟油的接触面积，提高了反应的传质效率，而且能够激发液体脂肪酶的催化活性，同时水的加入也降低了甲醇的浓度，减弱了对酶的活性抑制，最大化发挥了酶的催化活性。但过量的水的加入，不仅会稀释反应物浓度，而且会促进反应体系中水解反应的进行，从而导致酯化反应的逆向进行，降低了生物柴油的产率。因此，确定加水量为油重的10%为最佳加水量。

2.1.4 反应温度的影响

生物柴油的转化率呈现先上升后下降的趋势，并且在温度为45 ℃时，生物柴油有最大的转化率，其转化率为94.38%。随着温度的升高，反应体系中的分子运动速率不断增大，物质碰撞的几率也就不断增大，液体脂肪酶也由于温度的升高达到了能够更好发挥转酯活性的构象。但是当温度继续上升时，虽然反应体系中的分子运动速率不断增大，但随着温度继续升高，液体脂肪酶会发生变性，导致部分酶失活，从而使反应体系中酶的催化活性降低，所以此时的生物柴油的产率下降。所以本实验的最佳反应温度为45 ℃。

2.1.5 酶添加量的影响

当液体脂肪酶添加量从0.2%升至0.5%时，生物柴油的产率逐步提高，从72.92%上升到94.38%，酶的添加量增大时，反应中酶提供的活性位点也增多，增大了甲醇与地沟油的反应速率，进而升高了生物柴油的产率。当酶添加量继续增大到0.6%时，生物柴油的产率却下降到了92.30%，原因是当底物浓度保持不变时，过量的酶的加入不会增大酶促反应速率，反而过量酶的加入导致反应体系中酶产生聚集，酶与油接触面积减少，限制了反应的传质速率。因此酶添加量为0.5%时为最合适酶添加量。

结论

本研究采用喷射流回路反应器，以液体脂肪酶为催化剂催化地沟油和甲醇反应合成生物柴油，在单因素实验优化得最佳反应条件为地沟油与甲醇摩尔比为6:1，加酶量0.5%（以原料油重量计），反应温度为45 ℃，加水量10%，在最佳优化条件下反应3h，生物柴油产率可达94.3%，为使用喷射流回路反应器进行酶法生产生物柴油的工业化生产提供了技术支持。