利用高分子多基元协同效应增强脂质体稳定性的研究

脂质体是磷脂分子通过疏水作用在水溶液中自发形成的球形组装体，其水溶性的内腔和油溶性的磷脂双分子层，为递送不同溶解性的药物分子提供了良好平台. 目前，已有多种以脂质体为载体的药物获得FDA批准进入临床，如：Doxil™、ONPATTRO™等[1]. 研究表明，脂质体的稳定性决定了其在体内循环时间与到达作用靶点的载体数量，从而能够直接影响药物治疗效果. 因此，提高脂质体药物载体的稳定性在药物载体的构建中十分重要[2~6].

脂质体的不稳定主要是由于脂质体膜与血清蛋白、表面活性剂等分子相互作用以及双分子层自发的聚集、融合等动态过程所导致的膜融合与破裂[7]. 研究表明，将线性高分子引入至脂质体表面形成的水化层，可以对脂质体起到良好的稳定效果[8]. 很多课题组开发了基于电中性高分子聚乙二醇(PEG)修饰脂质体的载药平台，提高了多种载药体系的稳定性[9~12]，降低人体对其清除速率. Ishihara课题组还利用水溶性高分子包被脂质体，延长了内容物包埋在脂质体内部的时间，并通过实验证明通过加入水溶性高分子可提高脂质体在血浆中的稳定性[13]. Meland课题组则利用修饰的天然高分子包被脂质体，降低了脂质体保存过程中的内容物外流和脂质体聚集[14]. 除了电中性高分子，也发展了电荷物质包被脂质体的策略，如Kepczynski课题组通过静电相互作用使富含正电荷的聚丙烯胺盐酸盐衍生物包被含有负电荷磷脂的脂质体膜上，能在血清培养过程中有效阻止血清蛋白进入膜内导致脂质体通透性增强而发生内容物外流[15,16].

在发展直接引入高分子方法的同时，科学家还开发了原位聚合的策略构建高分子包被脂质体，提高其稳定性. 其中，位于脂质体亲水表面的原位聚合反应可以在膜表面构建高分子包被. van Herk课题组利用静电相互作用在阳离子脂质体膜外富集负电荷分子，通过化学交联的方式原位形成高分子聚合物壳层结构，使其整体结构在Triton X-100条件下能够得到保护[17]. Fournier课题组利用聚合酶原位催化磷脂表面DNA链增长，在膜上构建DNA交联网络，具有明显的稳定作用[18]. 同时，科学家们还开发了在磷脂膜疏水区域的原位聚合方法，如：Ringsdorf通过光引发含碳碳三键的磷脂分子在形成脂质体后的膜内发生聚合[19]；Meier通过引发油溶性单体和交联剂在磷脂双分子层内聚合形成高分子壳层[20,21]. Aspinwall课题组将乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)通过2,2-二乙氧基苯乙酮(DEAP)的催化作用在磷脂双分子层中原位形成疏水高分子壳层，并可以有效地抵抗表面活性剂导致的脂质体裂解[22]；同样使用EGDMA并将甲基丙烯酸正丁酯(BMA)单体引入至磷脂双分子层内[23]，原位引发聚合形成高分子骨架，在提高脂质体稳定性的同时保证了内容物的生物活性.

近日，受细胞膜“细胞骨架-膜蛋白-脂质双层”原理的启发，本课题组提出并开发了“框架诱导组装(Frame-Guided Assembly，FGA)”策略[24~27]，在抑制脂质体自发聚集、融合等动态过程方面取得了重要的进展. FGA策略利用各种具有精确控制特性的纳米材料作为框架，通过将分散的疏水分子锚定在框架上，可以构建出不连续的疏水定位基团平面[28]/内[29]/外[30]框架，这将进一步诱导系统中的两亲分子可控组装并形成所预期的二维或三维膜结构. 在框架诱导组装过程中，框架中的定位基团表现出了多基元协同效应. 在同一框架上且三维分布的定位基团与磷脂双分子层同时相互作用，因此可在长程范围有效抑制膜的波动和变形，从而大幅度提高脂质体的稳定性[31~34]，在与血清共培养中表现出良好的单分散性和膜完整性，并作为高稳定载体实现了在药物递送方面的应用[35].

科学家们在开发脂质体稳定体系和高稳定脂质体制备策略方面已经取得了长足的进步，但为了进一步发展长循环脂质体药物并实现更多的临床应用，继续研发新的脂质体稳定体系依然有很大的必要性. 受到框架诱导组装策略的启发，在本工作中，我们合成了接枝了插膜基团的线性高分子，利用高分子链的多基元协同效应[36,37]，通过简便的共混复合策略，制备了具有高稳定性高分子-脂质体复合物. 相较于PEG修饰磷脂在脂质体膜外形成水化层从而提高稳定性，插膜高分子的每一个基元之间还存在由高分子主链的共价键连接，通过多基元协同相互作用更大程度上提高了脂质体膜的稳定性. 该制备策略过程简单，有效地屏蔽了脂质体表面电荷，抑制了电荷介导的融合和表面活性剂对脂质体结构的破坏，可以延长脂质体在生理环境下保存时间. 该复合策略可有效提高脂质体稳定性，在长循环递送药物领域中有广阔的应用前景.

1 实验部分

1.1 主要材料

1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二(9Z-油酰)-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二-(9Z-十八碳烯酰)-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)(DOPS)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、[N-(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)-1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(NBD-PE)、N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)-1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(Liss Rhod PE)购于Avanti Polar Lipids, Inc.；8-氨基-1,3,6-萘三磺酸二钠盐(ANTS)、1,1'-(1,4-亚苯基双(亚甲基))双(1-吡啶鎓)二溴化物(DPX)、去乙酰化壳聚糖购于Sigma Aldrich公司；胆固醇、异硫氰酸酯荧光素(FITC)购于希恩思公司；N-羟基丁二酰亚胺(NHS)-PEG2000-胆固醇购于Nanocs，Inc.；3-(3-(胆酰胺丙基)二甲氨基)丙磺酸内盐(CHAPS)购于Meryer公司；1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=7.4)、磷酸盐缓冲液(PBS) (pH=7.4)、胎牛血清(FBS)购于Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)、D-山梨糖醇购于TCI公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购于百灵威公司；Zeba Spin Desalting Column 7k MWCO和10k MWCO透析袋购于Thermo Fisher公司；盐酸阿霉素(DOX)购于源叶生物公司.

1.2 脂质体的制备

1.2.1 小型脂质体制备