大连樱桃保藏过程致腐微生物分离鉴定及系统发育树绘制

樱桃（Cerasus spp.），又名车厘子，有“百果第一枝”的美誉。属蔷薇科李属的多年生木本植物。樱桃娇小玲珑，晶莹剔透，圆若珍珠，赤若玛瑙，被誉为“水果中的钻石”。据《本草纲目》记载：“蛇咬，捣汁饮，并敷之”。樱桃富含多酚和维生素C等多种营养成分，这些成分有助于减小慢性炎症性疾病的患病风险，同时有助于减轻氧化压力、炎症、高血压、关节炎、以及心血管疾病等健康问题。樱桃还富含花色苷、紫苏醇、堪非醇和褪黑激素等成分，具有较好的抗氧化作用。其游离二价铁含量是菠菜的 3～5 倍，动物实验表明其具有良好的补血效果。樱桃果肉肉质柔嫩，皮薄多汁，因此容易受损，从采摘到销售，整个过程容易出现果梗干枯褐化和果实腐霉问题。据研究，葡萄孢属 ( Botrytis sp.)、草酸青霉( Penicillium oxalicum)均能引起甜樱桃腐烂。文章通过对大连樱桃在贮藏过程中出现的腐烂组织块进行研究，分离及纯化出致病菌，并进行PCR扩增测定序列，进行其系统发展树的绘制，为大连樱桃的相关研究提供参考。

一、材料与方法

1.材料

（1）实验材料。樱桃，产地大连。

（2）试剂与仪器。70%乙醇、胰胳大豆胨培养基（TSB）、琼脂粉、细菌基因组提取试剂盒、磁珠法细菌和真菌基因组提取试剂盒、琼脂糖、PCR 产物磁珠法纯化试剂盒、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、电子天平、心机、PCR 仪、电泳仪、测序仪、BGI 2xSuper PCR Mix(with dye)、BGI D2000 Plus DNA Ladder

2.方法

（1）胰胳大豆胨琼脂培养基（TSA）配备。按照胰胳大豆胨培养基（TSB）说明书，按比例配备胰胳大豆胨液体培养基，加入体积的18%配成胰胳大豆胨琼脂培养基（TSA）。

（2）致病菌分离纯化。通过手术刀切除腐烂部分的大连樱桃，将这些腐烂组织块浸泡70%乙醇溶液中，约30秒，迅速将其置于无菌纸上，使其吸干乙醇溶液。随后，使用无菌水清洗组织块，然后将它们植入预备好的TSA培养基中，在28℃的恒温箱中培养48小时。

通过上述培养方法，获得两种形态不同的真菌。利用接种环进行挑离并划线传代。在分离纯化3-4次后获得两株纯菌株A₁和A₂。

（3）光学显微镜镜检。对从腐烂的大连樱桃组织中分离并纯化的两个菌株A₁和A_2，在TSA平板上生长的菌落进行观察，随后，采用无菌针挑取菌落的一小部分，在光学显微镜下进行检查，以研究菌落的外观特征。

（4）基因组DNA提取

柱式法提取。取一个2 ml 的离心管，加入200 µL的预处理液和适量的小玻璃珠，然后加入相应量的菌样品。将这混合物放入研磨仪中，进行充分混合的研磨。接着，加入20 µL Proteinase K，再加入200 µL的裂解液，充分颠倒混匀，随后在70℃环境下放置10分钟。然后，加入200 µL的无水乙醇，进行充分颠倒混匀，最后轻轻离心以去除管盖内的液滴。

进行吸附柱处理，使用洗涤液进行一次洗涤，随后进行两次漂洗液的洗涤。将吸附柱放置在室温下3-5分钟，确保吸附材料中的残留漂洗液充分晾干。然后将吸附柱内容物转移到一个新的离心管中，向吸附膜的中间位置悬滴50～100 µL ddH₂O，在室温下静置3-5min，以12000rpm/min的速度离心2min，将溶液收集到离心管中。

磁珠法提取。按照试剂盒说明书分装样品板、磁珠板、洗涤板、洗脱板，并放置提取仪对应工位，运行细菌提取程序至结束。

（5）18S扩增。对真菌基因组DNA进行PCR扩增，使用表1中列出的引物。每个PCR反应体系的总体积为25 µL，其中PCR Mix占比21 µL，正向引物和反向引物各占比1 µL，模板DNA占比2 µL。扩增的程序和PCR反应条件可见表2。

表1  18S PCR扩增引物

表2  PCR 扩增反应体系和条件

（6）PCR产物分析和提纯。取3 µL 的PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶检测，以观察DNA条带的特征。通过凝胶成像分析系统检查PCR扩增后的DNA条带是否明显。

为了纯化PCR产物，采用了磁珠纯化标准操作流程。该过程利用磁珠的原理，根据物质的电荷特性，在高盐和低pH条件下吸附DNA，然后在低盐和高pH条件下释放DNA，从而实现对DNA产物的分离和纯化。

（7）测序。通过试剂盒对 PCR 得到的 DNA进行切胶回收，然后进行纯化，最终进行测序分析。

（8）系统发育树的构建。使用NCBI中的Blast工具将已测序的DNA与GenBank数据库中已记录的DNA序列进行比对，以寻找同源性相似性。如果 18S rDNA 序列的同源性大于98%，则被判定为同一个物种。为了计算遗传距离，选取属内同源性较高的序列，并使用 Mega 6.0 软件构建系统发育树。

二、结果与分析

1.致病菌分离生长结果。对大连樱桃腐烂组织进行菌分离纯化后，得到菌株A1及菌株A2，形态评价见表3。

表3  菌株A1与A2菌落形态评价

2.2光学显微镜镜检结果

取菌株A₁和A₂少许菌落组织在光学显微镜下观察，菌A₁、菌A₂镜检结果评价见表4。

表4 菌株A₁与A₂菌落镜检结果评价

3 .PCR扩增与测序结果。对贮藏过程中大连樱桃腐烂组织中分离纯化的致病菌提取基因组DNA提取后，对其进行稀释以制备PCR的反应模板。然后，使用真菌的18S rRNA区域，采用ITS1和ITS4引物进行PCR扩增。得到长度约为700 bp左右的序列。其琼脂糖凝胶检测结果见图1。在测序中，菌株A₂测序套峰，无法拼接比；菌株A₁正常。

4.发育树绘制。从大连樱桃腐烂组织中鉴定分离得到菌株A₁，将PCR扩增产物进行测序，最终获得菌株A₁的18S rDNA基因序列。将其18S rDNA基因序列与 GeneBank中的序列进行Blast，结果见表3，选取相近的典型菌株的基因序列，用 Mega 6.0 软件构建系统发育树见图2。从所构建的系统发育树来看，A₁ 和 Coprinopsis pseudofriesii strain SZMC-NL-2631(HQ847016.1)亲缘关系较近。

表3 Blast结果

三、结论

从大连樱桃保藏过程中腐烂组织中分离纯化的菌种A₁，在形态及显微镜镜检下观察，可见其菌落特征及形态上具有真菌特点。通过PCR扩增及系统发育树的构建，发现其和 Coprinopsis pseudofriesii strain SZMC-NL-2631(HQ847016.1)有较近的亲缘关系，为后续研究樱桃保藏提供理论基础。