石榴皮提取物对贮藏期间牦牛肉糜蛋白质氧化及挥发性风味物质的影响

牦牛生活在青藏高原及其邻近的高海拔地区，牦牛肉一直被认为是良好的肉类来源，具有营养价值高、蛋白质含量丰富、脂肪含量低等优点[1]。牦牛肉糜是肉肠、肉脯、肉饼、肉馅、肉丸等多种产品的主要构成材料，牦牛肉糜加工成败直接影响到这些产品的品质。但是，牦牛肉糜在贮藏过程中，产生的大量自由基攻击蛋白质后会引起蛋白质氧化损伤，降低包括风味在内的肉的品质。据报道，许多植物提取物富含酚类物质，自由基清除能力强，可减少肉品在贮藏过程中的氧化损伤[2]。

石榴皮是石榴果实榨汁后的副产品，含有丰富的生物活性物质，如酚酸、类黄酮和水解单宁[3]，具有很好的自由基清除能力和抗氧化作用。研究表明，在冷藏牛肉丸中添加石榴皮提取物(pomegranate peel extract，PPE)后可抑制羰基的积累和疏基的损失，降低蛋白质的氧化程度[4]；在生猪肉饼中添加PPE，也具有良好的抗氧化作用及减少蛋白质的氧化损伤[5]。

目前，PPE在肉制品抗氧化、抑菌方面的研究报道较多，但是少有涉及到PPE对贮藏过程中牦牛肉糜二聚酪氨酸及色氨酸等蛋白质氧化情况和挥发性风味物质影响的研究。本研究以牦牛肉糜为研究对象，选用不同质量分数(下同)的PPE添加到牦牛肉糜中，以肌原纤维小片化指数(myofibrillar fragmentation index,MFI)、表面疏水性、二聚酪氨酸含量和色氨酸作为蛋白质氧化评价指标，同时采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(head space solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS)技术测定4 ℃贮藏过程中牦牛肉糜挥发性风味物质的变化情况，旨在为石榴副产物的开发利用和牦牛肉糜的保鲜提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牦牛肉，红原县国中食品有限责任公司；石榴皮提取物40%鞣花酸(HPLC)(CSLP-C-A001940)，陕西嘉禾生物科技有限公司；

二丁基羟基甲苯(butylated hydroxy toluene,BHT)，上海源叶生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BR级)，上海如吉生物科技发展有限公司；溴酚蓝、KCI、K2HPO4、KH2PO4、EDTA、MgCl2、NaC1、Na2HPO4、NaH2PO4，均为分析纯成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

FSH-2A高速匀浆机，江苏金坛市医疗仪器厂；紫外分光光度计，龙尼柯仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；九阳JYL-D05绞肉机，九阳股份有限公司；PL30型分析天平，梅特勒-托利多(上海)股份有限公司；TDZ5-WS离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；F-4700荧光分光光度计，日本株式会所日立高新技术科学那珂事业所；Trace DSQ型GC-MS联用仪，美国Thermo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 牦牛肉糜制作

参照阮仕艳等[6]的方法，将解冻好的牦牛肉洗净，除去可见脂肪与结缔组织，切成小块，用绞肉机(6 mm孔板)绞碎，将肉糜分成6个处理组，如表1所示。充分混合均匀后，将肉糜制成50 g的肉饼，每3个肉饼放入1个聚丙烯包装盒中，用保鲜膜封好，置于4 ℃冰箱冷藏，分别在第1、3、6、9天测定各项指标，每次测定重复3次。

表1 肉糜处理组
Table 1 Meat treatment group

注：NaCl、BHT、PPE添加量以肉糜质量为基准均为质量分数(下同)

1.3.2 MFI的检测

参考郑娇等[7]的方法进行测定。称取2 g牦牛肉糜，加入20 mL预冷的MFI缓冲液(100 mmol/L KCl、11.2 mmol/L K2HPO4、8.8 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L MgCl2)，冰浴条件下匀浆(12 000 r/min，40 s，每次10 s，中间间隔10 s)，于1 000×g离心15 min(4 ℃)，弃掉上清液。在沉淀中加入15 mL预冷的MF1缓冲液将沉淀充分悬浮，再离心(1 000×g，15 min，4 ℃)，弃掉上清液。沉淀用7.5 mL预冷的MF1缓冲液充分悬浮后，用滤布过滤去除结缔组织，再用7.5 mL预冷的MFI缓冲液冲洗离心管并过滤，合并滤液得肌原纤维蛋白悬浮液。采用双缩法测定所得蛋白质浓度，再用MFI缓冲液调整蛋白质质量浓度至0.5 mg/mL，在540 nm处测定吸光度。所得结果乘以200即可得到MFI值。

1.3.3 表面疏水性的检测

参照贾娜等[8]的方法加以修改。调蛋白液质量浓度为2 mg/mL，取1 mL蛋白溶液加入200 μL的1 mg/mL溴酚蓝，混匀，然后离心15 min(6 000 r/min，4 ℃)。取上清液稀释10倍，在595 nm处测定吸光值。表面疏水性以溴酚蓝结合量表示，按公式(1)计算：

溴酚蓝结合量

(1)

式中：A样品，在595nm波长处测定吸光值；A空白，以磷酸缓冲液代替蛋白溶液进行相同操作测定值。

1.3.4 二聚酪氨酸的检测

参考邓思杨等[9]的方法加以修改。取2 mg/mL的蛋白溶液，利用F-4700荧光分光光度计测定荧光强度。其中，发射波长420 nm，激发波长325 nm，狭缝宽度均匀5 nm，电压400 V。二聚酪氨酸含量表示为测得的吸光值除以蛋白浓度，为相对荧光值，单位为AU。计算如公式(2)所示：

相对荧光值

(2)

式中：A样品，利用F-4700荧光分光光度计测定吸光度，为蛋白质溶液质量浓度，mg/mL。

1.3.5 色氨酸的检测

参照李玲等[10]的方法加以修改。内源色氨酸荧光强度的变化通过F-4700荧光分光光度计进行检测。调蛋白质量浓度为1 mg/mL，吸取3 mL置于荧光比色皿中，室温条件下于283 nm处激发，记录295～400 nm的发射光谱供后续分析。激发和发射狭缝宽度均设置为5 nm，电压为400 V。

1.3.6 挥发性风味物质的检测

参考张杰等[11]的方法，采用SPME-GC-MS法测定牦牛肉糜中的挥发性风味物质。称取牦牛肉糜样品2 g置于顶空瓶中，50 ℃下平衡30 min，SPME针头萃取10 min后插入GC-MS进样器，进样口温度220 ℃，解析时间10 min，收回纤维头，拔出萃取头。

GC条件：TG-WaxMS B色谱柱；载气为氦气。色谱柱起始温度50 ℃保持2 min，以15 ℃/min升温至100 ℃，再以5 ℃/min升温至220 ℃，恒定流速为1.0 mL/min。

MS条件：EI离子源，电子能量为70 eV，GC-MS接口温度220 ℃，质荷比扫描范围45～450 amu。

结果经计算机自动检索(NIST 08)进行定性分析，同时由Thermo Xcalibur 2.2软件系统完成自动对照检索，要求正反向匹配值均大于800；最后根据峰面积的相对含量(%)进行化合物的定量分析。

1.4 数据统计与处理

采用SPSS 18.0软件进行数据统计处理、主成分分析与聚类分析，用ANOVA进行方差分析和显著性分析，处理组之间的差异显著性采用Duncan′s法进行多重比较，P<0.05表示差异显著。用Origin 2017软件作图。

2 结果与分析

2.1 PPE对贮藏期间牦牛肉糜MFI的影响

肌原纤维小片化是指肌原纤维在Z线附近断裂成较短段的现象，MFI是根据1～4个肌节长的肌原纤维百分比计算的，反映了贮藏期间肌原纤维的结构完整性[12]。PPE对牦牛肉糜MFI的影响如图1所示，随着贮藏时间的延长，各处理组MFI不断增加且差异显著(P<0.05)，表明肌原纤维和蛋白质结构的完整性遭到破坏，这可能与蛋白质氧化后肌原纤维间隙变大，接触氧的机会更多，从而加剧小片化的速率有关[13]。0.01%BHT处理组的MFI在整个贮藏期内显著低于空白对照组(P<0.05)。相反，0.01%、0.05%PPE处理组的MFI显著高于空白对照组(P<0.05)，这可能是因为酚类化合物可诱导肌原纤维蛋白的结构改变，并导致肌原纤维小片化[14]。0.10%、0.20%PPE处理组的MFI显著低于空白对照组(P<0.05)，0.20% PPE的添加量对贮藏期内MFI增加的抑制效果最好，可较好地维持肌原纤维的结构完整性，这可能是因为高浓度的PPE中羟基数量增加，与肌原纤维蛋白的反应活性增强，可以很容易地通过每个可能的结合位点与蛋白质相互作用，导致蛋白质交联，同时，蛋白质的聚集可能导致肉糜形成更紧凑的结构，将肌原纤维中的水分排出，有助于MFI的降低。这与GAO等[14]的研究结果一致，即随着多酚含量的增加，MFI增加；当多酚含量达到一定程度时，MFI降低。但CLAUSEN等[15]研究发现，在氧化环境下，蛋白质水解酶失活，蛋白质水解程度降低，MFI随之降低。因此，MFI的变化可能是蛋白质氧化变性、PPE与蛋白质相互作用以及蛋白质水解酶综合作用的结果。

图1 PPE对牦牛肉糜MFI的影响
Fig.1 Effect of PPE on MFI of yak minced meat 注：相同贮藏时间、不同处理组之间小写字母不同表示 差异显著(P<0.05)；不同贮藏时间、同一处理组大写 字母不同表示差异显著(P<0.05)(图2、3同)

2.2 PPE对贮藏期间牦牛肉糜表面疏水性的影响

蛋白质表面疏水性是指与极性水环境接触的蛋白质分子表面疏水基团的数量，与蛋白质分子的功能性质密切相关[16]，可以用来反映蛋白质的变性程度。表面疏水性越高，说明蛋白质分子内部的疏水性氨基酸残基暴露越多，蛋白质氧化变性程度越大。如图2所示，随着贮藏时间延长，各处理组表面疏水性整体呈上升趋势，表明在贮藏过程中，肉糜蛋白质不断被氧化，引起结构改变，表面疏水性增大[17]。贮藏第1天，与空白对照组相比，0.01%PPE处理组的表面疏水性无显著差异(P>0.05)，其余处理组均显著低于空白对照组(P<0.05)。从第6天开始，各PPE处理组表面疏水性均显著低于空白对照组(P<0.05)，其中，0.20%PPE处理组最低、效果最好，说明在牦牛肉糜中添加PPE后可抑制蛋白质氧化，降低蛋白质的变性程度。研究表明，甘草[18]、洋葱皮[17]提取物也可减缓贮藏过程中蛋白质表面疏水性的增加，而贮藏过程中蛋白质分子间由于疏水相互作用形成的聚集物，会掩盖原本的疏水位点，使表面疏水性降低[18]。然而，CAO等[19]研究发现，绿原酸在高浓度条件下可诱导肌原纤维蛋白表面疏水性进一步增加，促进氧化条件下蛋白质的进一步展开。

图2 PPE对牦牛肉糜表面疏水性的影响
Fig.2 Effect of PPE on the surface hydrophobicity of yak minced meat

2.3 PPE对贮藏期间牦牛肉糜二聚酪氨酸含量的影响

在蛋白氧化过程中酪氨酸容易被活性氧自由基氧化攻击，产生的酪氨酸自由基和酪氨酸残基可通过共价键和非共价键相互作用形成二聚酪氨酸[20]。因此，二聚酪氨酸含量可在一定程度上反映蛋白氧化程度和蛋白结构的变化，即二聚酪氨酸含量越高，蛋白质氧化程度越高，结构变化越大。如图3所示，贮藏9 d内，各处理组的二聚酪氨酸含量显著上升(P<0.05)，其中，空白对照组的上升幅度最大，从贮藏第1天的4.432 AU增加到贮藏第9天的6.675 AU，这可能是因为在贮藏过程中，蛋白质发生较严重的氧化反应，产生较多的酪氨酸残基，彼此之间相互聚合导致二聚酪氨酸含量增加和蛋白结构变化。贮藏第3、6天，添加PPE后可显著抑制牦牛肉糜中二聚酪氨酸含量的增加(P<0.05)。贮藏9 d结束时，0.20%PPE处理组二聚酪氨酸含量相比空白对照组降低27.63%且差异显著(P<0.05)。与空白对照组相比，其他抗氧化剂处理组均能显著抑制牦牛肉糜贮藏过程中二聚酪氨酸含量的增加(P<0.05)，表明PPE与BHT均有很好的抗氧化效果。综上，添加0.20%PPE可抑制二聚酪氨酸含量的增加，效果最好。有研究表明，桑葚多酚[21]、生姜提取物[22]等具有抗氧化活性的物质均能抑制二聚酪氨酸含量的增加。但蛋白质在强氧化条件下，二聚酪氨酸含量会出现下降的情况，这可能是由于酪氨酸残基被完全氧化，也可能是蛋白质分子发生交联和聚集后，埋在蛋白质分子内部的二聚酪氨酸无法被检测出来[23]。

图3 PPE对牦牛肉糜二聚酪氨酸含量的影响
Fig.3 Effect of PPE on the dityrosine content of yak minced meat

2.4 PPE对贮藏期间牦牛肉糜色氨酸的影响

色氨酸是一种重要的芳香族氨基酸，通常被包埋在蛋白质的内部，其吲哚环对环境非常敏感，因此可以作为蛋白质结构变化的指示物[24]。牦牛肉糜色氨酸荧光强度的变化如图4所示，随着贮藏时间的延长，各处理组的色氨酸荧光强度呈下降趋势，在贮藏第9 d时达最低值。荧光强度降低的主要原因可能是氧化引起蛋白质三级结构被破坏，结构展开后导致更多疏水位点暴露，使得蛋白质溶解度降低和分子疏水聚集增强，因此荧光发射降低[25]。在贮藏期内，牦牛肉糜蛋白质不断发生氧化，0.01% BHT处理组的荧光强度始终高于空白对照组，表明蛋白质侧链中的荧光氨基酸被猝灭可能与蛋白质氧化有关。但是，蛋白氧化程度增加、其他氨基酸产生荧光干扰可能使色氨酸内源荧光强度增大[23]。在牦牛肉糜中添加PPE后，引起色氨酸荧光强度降低，且添加量越大，荧光强度越低，这表明PPE与牦牛肉糜蛋白可能发生相互作用，使得蛋白质的空间结构展开，色氨酸等荧光基团暴露在极性环境中，使得荧光强度降低。多酚与蛋白质的相互作用方式包括共价键和非共价键，如二硫键、疏水相互作用、氢键等[26]。研究表明，芦丁[27]、表儿茶素[28]、绿原酸[19]等多酚均会引起色氨酸荧光强度的降低。

2.5 PPE对贮藏期间牦牛肉糜挥发性风味物质的影响

2.5.1 不同处理组牦牛肉糜的主成分分析

牦牛肉糜在4 ℃贮藏期间生成挥发性风味物质的主要途径是脂肪氧化、酶和微生物作用。由表2可知牦牛肉糜中共检测出九类挥发性风味物质，包括酸类(8种)、烃类化合物(31种)、醇类(28种)、酚类(3种)、醛类(12种)、醚类(5种)、酮类(9种)、酯类(13种)。

由于构成牦牛肉糜挥发性风味物质的种类较多，因此采用主成分分析法来简化数据，一般当特征值大于1和累计贡献率>70%时就可作为主成分[29]。如表3所示，经主成分分析提取的3个主成分，其特征值均大于1，累计方差贡献率为73.812%，基本反映了所有变量的初始信息，因此，选用前3个主成分作为数据分析的有效成分。

各主成分的载荷值代表该主成分对该类物质反映程度的大小[30]，本次研究中采用载荷的绝对值大于0.6为判断依据[29]。由表4可知构成PC1的是酸类、杂环及其他类、醛类、醇类、酮类、醚类；构成PC2的是酚类、烃类；构成PC3的是酯类。

A-贮藏第1天；B-贮藏第3天；C-贮藏第6天；D-贮藏第9天
图4 PPE对牦牛肉糜色氨酸荧光强度的影响
Fig.4 Effect of PPE on the tryptophan fluorescence intensity of yak minced meat

表2 贮藏过程中挥发性风味物质类别及相对含量变化
Table 2 Changes in the types and relative contents of volatile flavor substances during storage

注：“-”表示未检出

表3 主成分的特征值和贡献率
Table 3 Eigenvalue of the principal components and their contribution rates and cumulative contribution rates

表4 主成分的特征向量与载荷矩阵
Table 4 Principal component eigenvectors and loading matrix

注：表中的“-”表示该变量在对应的主成分中的载荷绝对值小于0.6

2.5.2 不同处理组牦牛肉糜挥发性成分综合评价模型的建立

根据3个主成分九类物质各自的特征向量，计算各主成分得分，用F1、F2和F3表示，公式如下：

F=0.395F1+0.178F2+0.164F3

F1=-0.291X1+0.215X2+0.234X3-0.179X4+0.221X5+0.143X6+0.051X7-0.008X8-0.005X9

F2=0.142X1+0.022X2-0.258X3-0.162X4+0.015X5+0.299X6-0.493X7+0.433X8+0.031X9

F3=-0.205X1-0.101X2-0.004X3+0.180X4+0.407X5-0.239X6+0.076X7+0.232X8+0.566X9

式中：X1～X9分别对应酸类、杂环及其他类、醛类、醇类、酮类、醚类、酚类、烃类、酯类9个类别。

以3个主成分对应的方差贡献率作为加权系数，得到主成分综合评价模型：

如表5所示，0.05%PPE处理组在贮藏第1、3天时挥发性成分品质最好，其次是贮藏第1、3天的0.20% PPE处理组，空白对照组在贮藏第3天时挥发性成分品质最好，排名第3。在贮藏第1、9天时，空白对照组样品的综合排名均低于各PPE处理组，说明在牦牛肉糜中添加不同质量分数的PPE后可有效改善其挥发性成分品质。随着贮藏时间的YANCHANG ，各处理组综合排名整体呈逐渐下降趋势，表明肉糜新鲜度下降，品质降低，微生物活动、蛋白质和脂肪氧化以及酶的作用都是引起肉品腐败，导致新鲜度降低的重要因素。整体来看，0.01%、0.05%PPE处理组挥发性成分品质最好，0.10%、0.20%PPE处理组挥发性成分品质适中，空白对照组和0.01%BHT处理组挥发性成分品质最差。

表5 不同处理组牦牛肉糜成分得分及综合评估
Table 5 Principal component scores and comprehensive assessment of minced yak meat in different treatment groups

2.5.3 不同处理组牦牛肉糜的聚类分析

采用SPSS 18.0软件，采用类组间连接法，以牦牛肉糜中检测出的九类挥发性风味物质为依据，对6个处理组、4个贮藏时间点共计24个牦牛肉糜样品进行聚类分析，建立聚类树状图，结果见图5，样品序号同表2。当欧式距离为20时，24个样品可以聚为三类。在贮藏第1、3天的样品中，1号样品单独聚为一类，排名在11位，其余样品聚为一类；除5号样品排名在第17位外，其余样品排名在1～10位。贮藏第6、9天的样品，排名在12～24位，聚为一类。对比表5及图5结果发现，聚类分析与主成分分析结果具有一致性，即在贮藏第1、3天，各处理组牦牛肉糜新鲜度高，挥发性风味物质相对含量相似，综合排名靠前，可聚为一类；随着贮藏时间延长，牦牛肉糜新鲜度降低，综合排名靠后，聚为一类。

图5 二十四个牦牛肉糜样品的聚类分析谱系图
Fig.5 Dendrogram of HCA of 24 minced yak meat samples

3 结论

在牦牛肉糜贮藏过程中，较低的PPE添加量(0.01%、0.05%，质量分数)会增加其MFI，较高的PPE添加量(0.10%、0.20%，质量分数)则会降低其MFI。另外，PPE可抑制牦牛肉糜表面疏水性和二聚酪氨酸含量的增加，降低牦牛肉糜蛋白质氧化和结构变化的程度，但PPE中的酚类物质会引起色氨酸荧光强度的降低。通过主成分分析提取了3个主成分，PPE有助于牦牛肉糜风味的改善，提高牦牛肉糜的综合得分。聚类分析结果反映出贮藏过程中牦牛肉糜新鲜度不断降低。综合来看，PPE添加量为0.20%可有效抑制牦牛肉糜贮藏过程中蛋白质的氧化程度，改善风味，效果最好。该研究结果为PPE的进一步开发利用和牦牛肉糜的新型保鲜方法提供了一定的理论依据。