基于矿物元素技术的中宁不同产区枸杞的判别分析

宁夏中宁县作为中国枸杞的原产地和道地产区，人工种植枸杞的历史已达600年之久，因中宁枸杞与其他产地枸杞具有不同的独特品质，宁夏中宁县也被誉为“中国枸杞之乡”[1]，截至2018年年底，宁夏枸杞种植面积达6.67万hm2，枸杞干果总产量14万t，年综合产值130亿元[2]，枸杞产业已成为宁夏农村经济社会发展、农业增效、农民增收的重要支柱产业。目前，国内已注册的枸杞商标除中宁枸杞外，还有靖远枸杞、瓜州枸杞、精河枸杞、柴达木枸杞等[3]，随着枸杞地理标志保护产品的增多，假冒产品标识、以次充好的现象时有发生，严重损害消费者权益。

目前，产地溯源技术主要包括矿物元素分析技术、稳定同位素技术、有机成分指纹溯源技术、近红外光谱指纹溯源技术、拉曼光谱指纹溯源技术等[4]。矿物元素分析技术被认为是植源性食品产地判别较为有效的方法[5-7]，已被广泛应用于谷物[8-9]、橄榄油[10-12]、葡萄酒[13-15]、茶叶[16-18]等的产地溯源。电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)仪因具有高灵敏度、线性范围宽、可多元素同时测定等优势，是目前矿物元素测定最常用的技术[19-20]。枸杞中元素含量与产地环境因素密切相关，形成不同地区各自的元素特征，因此，筛选枸杞中与产地直接相关的元素指标作为产地溯源指标是其溯源研究的关键。MAIONE等[21]通过检测分析21种矿物元素对巴西大米进行分类精度研究，结果表明3种分类模型对巴西中西部、南部地区大米的产地预测准确度分别为93.66%、93.83%和90%；MA等[18]利用ICP-MS对洞庭碧螺春及其他绿茶样品中37种矿物质元素的含量进行了测定，构建判别模型的正确判别率为96.4%，实现了对相同和不同产地品牌绿茶的产地判别。

国内外学者利用矿物元素技术进行了大空间尺度的产地溯源应用，取得了理想的判别效果。本研究以中宁小尺度区域为例，采用矿物元素分析技术对中宁5个小产区(舟塔产区、鸣沙洲产区、红梧山产区、红柳沟产区和清水河产区)进行产地判别分析。研究矿物元素分析技术在小尺度区域内枸杞产地判别中的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

混合标准溶液，美国 Perkin Elmer公司，第1组标准溶液包括As、Ba、Bi、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Li、Mg、Mn、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Tl、U、Zn 21种元素混合标准溶液(Lot#18-195 JB)，第2组标准溶液包括B、Ge、Mo、Nb、Er 5种元素(Lot#20-134 JB)，第3组标准溶液包括Ce、Dy、Eu、Gd、Ho、Nd、Pr、Sm、Tb、Th、Tm、Y、Yb 13种元素(Lot#41-48AS)；N、P、K、Hg为单标元素，中国计量科学研究院，质量浓度为1 000 mg/L，共计43种元素。硝酸，德国默克；盐酸，国药化学试剂有限公司，均为优级纯；试验用水为一级水。

标准物质GBW 10047(生物成分分析标准物质—胡萝卜)为中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所研制。

1.2 仪器与设备

ELAN DRC-e型ICP-MS 仪，美国 Perkin Elmer公司；Mars6 Xpress微波消解仪(内置双光路温度控制系统和全罐异常压力监控系统)，美国 CEM 公司；AL104型电子天平，梅特勒-托利多。

1.3 实验方法

1.3.1 样品采集

枸杞样品于2018年6～10月采自宁夏中宁地区的5个小产区，舟塔产区(n=34)、鸣沙洲产区(n=14)、红梧山产区(n=24)、红柳沟产区(n=12)、清水河产区(n=27)。

1.3.2 样品前处理

枸杞鲜样晒干，置于50 ℃烘箱中烘干至粉碎时不黏壁，然后进行充分研磨，过100目筛后备用。

枸杞样品采用微波消解法消解，具体操作步骤：称取0.5 g (精确到0.000 1 g) 枸杞样品置于微波消解管中，加入硝酸10 mL，常温静置3 h后，放入微波消解仪中进行样品消解，选择温度控制，5 min爬升至120 ℃，保持10 min；5 min爬升至150 ℃，保持20 min；5 min爬升至190 ℃，保持30 min。消解完毕后冷却，轻轻拧开盖子，将微波消解管置于赶酸仪上120 ℃赶酸2 h，然后冷却至室温，用超纯水洗至50 mL刻度试管中，并用超纯水定容，摇匀；同时做试剂空白。

1.3.3 矿物元素含量测定

枸杞中N、P、K元素含量按照NY/T 2017—2011《植物中氮、磷、钾的测定》测定，K采用火焰光度计测定，N采用凯氏定氮仪法测定，P采用钼锑抗吸光光度法测定。枸杞其他矿物元素含量采用ICP-MS标准模式测定[22-23]。具体的工作条件为：发生器功率：1 300 W；雾化器流量：0.95 L/min；等离子炬冷却气流量：17.0 L/min；辅助器流量：1.20 L/min；检测器模拟阶电压：-2 350 V；离子透镜电压：6.00 V。仪器测定枸杞样品及胡萝卜标准物质中43种元素，标准物质测定值在标准值范围内，仪器元素的检出限和定量限见表1。

表1 ICP-MS仪器测定矿物元素标准曲线、检出限和定量限
Table 1 ICP-MS instrument determination of mineral elements standard curve, detection limits and limits of quantification

1.4 数据分析

采用SPSS 25.0进行单因素方差分析和主成分分析；采用SPSS 25.0和SIMCA 13.0分别进行Fisher判别分析和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA)。

2 结果与分析

2.1 不同产区枸杞中矿物元素含量差异分析

通过对舟塔产区、鸣沙洲产区、红梧山产区、红柳沟产区、清水河产区枸杞中43种元素含量进行方差分析。其中Ba、Bi、Cd、Ce、Cu、Dy、Eu、Gd、Ge、Hg、Ho、Mg、Mn、Mo、Nd、Ni、Pr、Se、Sm、Sr、Tb、Th、Tm、Yb、Ca、Pb、P、Er 28种元素含量在5个产区间存在显著差异(P<0.05)，元素As、B、Co、Cr、Cs、Li、Nb、Rb、Tl、U、Y、Fe、Zn、N、K 15种元素含量在产区间差异不显著(P>0.05)(表2)。

舟塔产区的Cd、Cr、Ge、Hg、Mo、Ni、Nb、Tl、Ca、Pb、P 元素含量高于其他产区，Ce、Dy、Gd、Ho、Nd、Sm、Tb、Th、Tm、Y、Fe、Pr、Er元素含量低于其他产区；鸣沙洲产区的Cu、Dy、Eu、Nb、Gd、Li、Mg、Rb、Yb、U、Fe元素含量高于其他产区，Sr元素含量低于其他产区；红柳沟产区的Bi、Mo、Mn、Nb、Li、Ni、P元素含量低于其他产区；红梧山产区的Ba、Bi、Ce、Ho、Nb、Nd、Pr、Sm、Sr、Tb、Th、Tm、U、Yb、Er元素含量显著高于其他产区，Cd、Cu、Ge、Hg、Ca元素含量低于其他产区；清水河产区的Co、Mn元素含量高于其他产区，Ba、Eu、Mg、Rb、Tl、U、Yb、Pb元素含量低于其他产区；中宁小尺度区域内各产区枸杞中矿物元素含量有其各自的地域特征，矿物元素在小尺度相似地域之间具有较大的差异性。

表2 不同产区枸杞中矿物元素含量 单位：mg/kg

Table 2 Mineral elements contents in Lycium barbarum samples from five growing regions

注：表中数据均为平均值±标准差；同行不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.2 枸杞中矿物元素的主成分分析

主成分分析是指通过将存在相关性的变量转换成线性不相关的变量，并提取完全没有相关性又保留了原始数据大部分信息的几个主成分[24-25]，本研究对中宁枸杞产区间存在显著差异的36种元素进行主成分分析，KMO统计量为0.809(KMO统计量>0.5)，各元素之间具有显著相关性，可以进行主成分分析，结果见表3。第1主成分方差贡献率为30.083%，综合了Pr、Tb、Sm、Nd、Dy、Yb、Ho、Ce、Tm、Gd、Th、Y、Eu、Bi 14种元素信息；第2主成分方差贡献率为12.741%，综合了Mo、Ge、Co元素信息；第3主成分方差贡献率为7.672%，综合了Tl、Rb、Cs元素信息；第4主成分方差贡献率为5.701%，代表了Mg、Mn元素信息；第5主成分方差贡献率为4.730%，代表了N、K、Li元素信息；第6主成分方差贡献率为4.225%，综合了Ca、P、Pb元素信息；第7主成分方差贡献率为3.640%，代表了Zn、Cu元素信息；第8主成分方差贡献率为2.798%，代表了Sr元素信息；第9主成分方差贡献率为2.613%，代表了Er元素信息；第10主成分方差贡献率为2.381%，代表了As元素信息；前10个主成分累计方差贡献率为76.583%。筛选出Pr、Tb、Sm、Nd、Dy、Yb、Ho、Ce、Tm、Gd、Th、Y、Eu、Bi、Mo、Ge、Co、Tl、Rb、Cs、Mg、Mn、N、K、Li、Ca、P、Pb、Zn、Cu、Sr、Er、As 33种枸杞的特征矿物元素。

表3 前10个主成分的载荷矩阵及方差贡献率
Table 3 Loading matrix and cumulative contribution to total variance of the first ten principal components

续表3

2.3 枸杞中矿物元素的判别分析

矿物元素含量的差异揭示了不同产区枸杞存在差异，但不足以对枸杞产区进行准确判别，为了实现对中宁不同产区枸杞的产地判别，分别采用Fisher判别分析和OPLS-DA方法对中宁5个产区枸杞样本进行判别分析。

2.3.1 基于Fisher判别分析的枸杞产区判别模型

为了进一步了解各元素含量指标对枸杞原产地的判别情况，建立基于Fisher判别函数的一般判别方法对枸杞样品进行多变量判别分析，以43种矿物元素作为判别分析的自变量，进行逐步判别分析，结果显示，Cd、Ce、Co、Cu、Gd、Hg、Mg、Se、Zn、P等10种矿物元素对产地判别显著的元素被引入到判别模型中。不同产地枸杞判别函数模型系数见表4，判别分类结果见表5。提取模型前4个典型判别函数，Willks’ Lambda检验结果进一步证实，在α=0.05的显著性性水平下，4个函数对分类效果均为显著，其中判别函数1和判别函数2累积解释判别模型能力为78.3%，且相关系数均>0.95，表明判别函数1和判别函数2对5个枸杞产地分类占主要贡献作用，利用判别函数1和判别函数2的得分值作散点图，见图1。舟塔、红梧山、清水河产区容易区分，分别位于不同空间，鸣沙洲产区和红柳沟产区样品有部分重叠。分类结果表明，回代检验的整体正确判别率为97.3%，回代检验是针对所有训练样本进行的检验，样品的错判率是相应总体率的偏低估计，而留一交叉检验比较真实地体现了模型的判别能力[26]，交叉检验中舟塔产区各有1个和4个样本分别误判为红柳沟和清水河产区，鸣沙洲各有2、2、1、1个样本被误判为舟塔、红柳沟、红梧山和清水河产区，红柳沟各有1个样本被误判为舟塔和红梧山产区，红梧山各有1个和3个样本被误判为红柳沟和清水河产区，清水河各有1个和2个样本被误判为舟塔和红梧山产区，交叉检验的整体正确判别率为82.0%，说明基于矿物元素指纹的差异可以有效鉴别不同产地的枸杞。

表4 不同产地枸杞判别函数模型系数
Table 4 Distinctive L. barbarum distinguish function model coeffieient

2.3.2 基于OPLS-DA的枸杞产区区分模型

对5个产区枸杞样本中的43种矿物元素含量进行OPLS-DA分析，构建溯源模型。OPLS-DA模型中，R2X(cum)与R2Y(cum)分别表示在X轴方向和Y轴方向上主成分1和主成分2对变量的解释能力，Q2(cum)表示模型对分组的预测能力[27]，该模型中R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2(cum)分别为0.709、0.598和0.499，说明建立的OPLS-DA模型中2个主成分能有效解释5个产区之间的差异，且该模型具有一定的预测能力。

表5 不同产区枸杞的一般判别分析结果
Table 5 General discriminant analysis of L. barbarum from different origins

图1 不同产区枸杞前2个典型判别函数得分散点图
Fig.1 Scattering points of the first two typical discrimination functions of L. barbarum from different origins

图2为OPLS-DA模型第1、2主成分得分图和载荷图。各个产区样品群体内有明显的聚集趋势，仅有1个红梧山的样本落在Hotelling T2椭圆图外，舟塔产区(ZT)、鸣沙洲产区(MSZ)可以较好地区分开，红柳沟产区(HLG)分别与清水河产区(QSH)和红梧山产区(HWS)样品有部分重叠。横坐标为第1主成分得分，通过第1主成分可以将舟塔、红梧山与清水河产区样品区分开；纵坐标为第二主成分得分，通过第2主成分可以将清水河产区与鸣沙洲产区区分。载荷图表示第1、2主成分中各指标与不同产区的相关性大小，即图中X变量与Y变量越靠近，其相关性越高。由图3可知，舟塔产区的Ge、Ni、Ca、Cu、P、Pb、Cd、Hg元素含量较高；鸣沙洲产区的Gd、Yb、Nd、Y、Li、Fe、U、B、Nb、Mg元素含量较高；红柳沟产区的N元素含量较高；红梧山产区的Ce、Th、Sm、Tb、Pr、Th、Ho、Dy、Bi、Er、Nd、Ba、Yb、Er等元素含量较高；清水河产区Co、Mn元素含量相对较高，这与矿物元素含量差异的分析结果相近。

利用建立的模型对5个产区的枸杞样品进行原产地判别(表6)。舟塔产区34个样品正确判别率为

a-得分图；b-载荷图
图2 OPLS-DA模型第1、2主成分得分图和载荷图
Fig.2 Scoring plot and loading plot of first versus second components in OPLS-DA

100%；鸣沙洲产区14个样品中2个误判，正确判别率为85.71%；红柳沟产区12个样品中有2个被误判，正确判别率为83.3%；红梧山产区24个样品中3个样品误判，正确判别率为87.5%；清水河产区27个样品2个误判，正确判别率为92.59%，111个样品的整体正确判别率为91.89%。

表6 OPLS-DA模型数据判别率
Table 6 Accuracy of OPLS-DA model by validation set

3 结论

通过分析宁夏中宁5个小产区枸杞中43种矿物元素含量的组成特征，明确了不同产区枸杞中28种矿物元素存在地域差异。通过主成分分析确定了Pr、Tb、Sm、Nd、Dy、Yb、Ho、Ce、Tm、Gd、Th、Y、Eu、Bi、Mo、Ge、Co、Tl、Rb、Cs、Mg、Mn、N、K、Li、Ca、P、Pb、Zn、Cu、Sr、Er、As 33种枸杞的特征矿物元素。Fisher判别分析确定了Cd、Ce、Co、Cu、Gd、Hg、Mg、Se、Zn、P 10种枸杞的有效溯源指标。Fisher判别分析方法构建的判别模型的回代检验和交叉检验的整体正确判别率分别为97.3%和82.0%，基于OPLS-DA建立的判别模型的整体正确判别率为91.89%，相比之下，OPLS-DA判别效果更好。模型的整体正确判别率较低，但综合考虑到中宁仅为一个县级区域，面积4 226 km2，这样一个小尺度区域内的枸杞产地正确判别率可以接受。通过多元统计方法基本实现了对小尺度区域范围内枸杞产地的有效判别。误判率相对较高的原因可能与产区划分有关，虽然实现了地域划分，但5个产区地域距离较近；同时样本数量不一致也是影响判别模型准确率的因素之一。结合以上分析，矿物元素技术结合多元统计分析方法对枸杞产地判别有效可行。该结果为下一步分析环境因素(土壤、水、肥料等)对枸杞矿物元素指纹信息的影响提供了基础数据。该模型的建立可用于枸杞原产地识别，对宁夏地理标志性产品及消费者合法权益的保护提供了有效的技术支撑。