凯里米酸汤挥发性成分HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS分析

凯里酸汤源于贵州黔东南苗族传统食品，包括糯米米汤为主要发酵原料的米酸汤(又称为白酸汤)和西红柿、辣椒为主要发酵原料的红酸汤[1]。凯里酸汤主要的发酵菌为乳杆菌以及明串珠菌、醋酸杆菌、产朊假丝酵母、毕赤酵母[1-2]。凯里酸汤具有调控血脂代谢，降低血甘油三脂、血胆固醇及升高高密度脂蛋白的作用[3]。米酸汤发酵后富含有机酸、氨基酸、矿物质元素、维生素等，具有较好的抗氧化能力[1-2]。用于米酸汤发酵的乳酸菌也具有缓解和预防腹泻、高血压、糖尿病和便秘[2-3]等生理功效。

挥发性成分是构成食品风味品质的重要物质，也是消费者喜好的决定因素之一。食品中的挥发性成分可以采用气相色谱质谱联用法(GC-MS)[4]、电子鼻法[5]、气相色谱离子迁移谱法(gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS)[6]、气相色谱嗅觉测量法[7]等研究。米酸汤风味独特，王思婷等[4]、田亚等[8]采用顶空固相微萃取结合气质联用(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)分别分析出米酸汤40种和109种挥发性物质成分。LIU等[9]分析了凯里周边地区10家企业和作坊的米酸汤产品风味物质，共鉴定出42种挥发性物质。WANG等[10]研究后发现不同白酸汤产品受工艺影响，风味物质差异显著。由于GC-MS存在检测时间长、前处理程序影响大、离子峰解谱较困难[11]，GC-IMS具有样品前处理简单、较好保留自身风味物质、小分子物质分辨率高等特点[12]，因此有必要采用多种挥发性物质检测方法协同分析凯里米酸汤挥发性物质成分。

本文采用HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS协同分析代表性凯里米酸汤产品挥发性物质成分。研究结果有利于加深对米酸汤挥发性风味物质成分认识，拓展GC-IMS技术应用范围，为最终改进凯里米酸汤风味品质提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

凯里地区3家著名企业各自刚结束乳酸发酵阶段的1个米酸汤批次。这3家企业分别是贵州省非物质文化遗产传承人创办企业、市场规模暂居最大的企业和具有三十余年创办历史的企业。随机选择每家企业9个发酵坛，在每个坛子中部50 cm处各自取样50 mL。每3个坛子取的样混匀为1个待测样品。每家企业制备出3个待测样品，-20 ℃贮存。3家企业样品依次编为MC、NH、YM。

标准品：乙酸乙酯(99.9%)、丙酸乙酯(99.5%)、丙酸丙酯(99.5%)、乙醇(99.8%)、正丙醇(99.9%)、异戊醇(99.8%)、仲辛醇(99.5%)、乙酸(99.8%)、丙酸(99.5%)、己酸(99.5%)、辛酸(99.5%)、壬酸(99%)，上海阿拉丁生化科技股份公司；C7-C40正构烷烃标样，美国o2si公司。

1.2 主要仪器

配置全自动顶空进样装置的FlavourSpec©风味分析仪，德国G.A.S.公司；PR124ZH电子天平，美国OHAUS公司；Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；配置磁力加热搅拌装置的固相微萃取操作平台、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头及联用手柄57356U，美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 HS-SPME-GC-MS测定挥发性成分

准确量取8 mL米酸汤样品置于15 mL顶空瓶中，加入磁性转子、1.5 g NaCl、8 μL 4.095 g/L的仲辛醇内标溶液，立即用聚四氟乙烯垫封口。样品在固相微萃取操作平台上40 ℃平衡15 min，再用老化后的萃取头顶空萃取25 min，随后手动进样，250 ℃解析8 min。

GC-MS条件：HP-INNOWax气相色谱柱(60 m×0.25 mm, 0.25 μm, 美国J&W公司)。前进样口温度250 ℃，载气(He) 流速1.0 mL/min，不分流进样。程序升温：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至150 ℃，以10 ℃/min升至230 ℃并保持5 min。色谱-质谱接口温度280 ℃，EI电离源，离子源温度230 ℃、电压70 eV；扫描范围m/z 35-500。

1.3.2 HS-GC-IMS测定挥发性成分

准确量取1 mL米酸汤样品置于20 mL顶空瓶，孵化转速500 r/min，45 ℃下孵育15 min后进样。

GC-IMS分析条件：色谱柱WAX 30 m ID 0.53 mm，柱温60 ℃，载气/漂移气均为≥99.999%氮气，IMS温度45 ℃，分析时间30 min。自动进样体积100 μL，进样针温度50 ℃。

气相色谱条件：0～2 min：漂移气150 mL/min，载气2 mL/min；2～20 min：漂移气150 mL/min，载气2 mL/min提升至100 mL/min；20～30 min：漂移气150 mL/min，载气100 mL/min。

1.4 米酸汤挥发性成分定性定量分析

HS-SPME-GC-MS定性分析方法:在标准信息库NIST 17.0中检索比对物质峰质谱信息，在匹配度≥70%条件下，结合RI值、标准品比对进行定性。

HS-SPME-GC-MS定量分析方法:采用内标半定量方法。根据各挥发性成分及仲辛醇峰面积的比值，按公式(1)计算出挥发性成分质量浓度：

(1)

式中:Ci，挥发性成分质量浓度，mg/L;Ai，挥发性成分峰面积;Ais，内标物峰面积;Vi，样品体积，L;mis，内标物质量，mg。

气味活度值(odor activity value, OAV) 计算方法:查阅出挥发性成分阈值，利用挥发性成分浓度与阈值的比值，按公式(2)计算：

(2)

式中:Ci，挥发性成分质量浓度，mg/L;Ti，该挥发性成分阈值，mg/L。

HS-GC-IMS定性分析方法:通过GC-IMS数据分析软件LAV查看分析图谱，利用Reporter插件比较二维和三维图谱差异，利用Library Search软件和仪器内置NIST、IMS数据库进行挥发性物质成分定性分析。

1.5 数据处理

利用GC-IMS的Gallery Plot插件进行不同米酸汤样品间挥发性成分含量差异比较，Dynamic PCA插件进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 凯里米酸汤HS-SPME-GC-MS分析结果

凯里米酸汤样品挥发性成分HS-SPME-GC-MS定性和半定量分析结果见表1。3种米酸汤样品一共鉴定出28种挥发性物质，包括10种醇类、10种酯类、3种酸类、1种酮类、1种呋喃类、2种醚类、1种酚类。3种米酸汤样品挥发性成分组成均以醇类、酯类和酸类化合物为主，这与前人对米酸汤挥发性成分研究结论较吻合[9]。3个代表性厂家米酸汤样品挥发性物质组成不一致。其中MC样品鉴定出23种挥发性物质、NH样品检测出21种、YM样品分析出18种。3个生产厂家产品中，只有乙酸乙酯、丁酸乙酯这2种挥发性物质成分的浓度差异不显著，且8种挥发性物质成分只出现在其中一家产品中，为正丙醇、正己醇、2-壬醇、苯乙醇、乙酸丁酯、丁酸丁酯、2-甲基呋喃、乙二醇乙醚。3家企业生产用发酵容器材质和规格、发酵温度、发酵时间、老水来源及配比、酿造用水和糯米等原辅料组成比例都有一定差异，可能是造成产品挥发性物质组成不同的原因[8,13]。

表1 不同米酸汤样品挥发性物质成分含量
Table 1 Content of volatile component in different rice sour soup samples

注：MS-质谱鉴定，RI-保留指数鉴定，STD-标准品鉴定；RI-HP-INNOWax气相色谱柱保留指数；同一行数值上标不同小写字母，代表在0.05水平上差异显著(P<0.05)；“-”代表未检出

表2的OAV可用于分析挥发性成分对风味贡献程度。OAV<1表示该成分质量分数低于阈值，具有修饰米酸汤风味作用；OAV≥1时，该成分对米酸汤整体风味特征具有较大贡献。由表2可见，YM样品中OAV≥1的特征香气成分有乙醇(2.43)、仲丁醇(1.82)、异戊醇(328.37)、正己醇(1.38)、2-壬醇(16.67)、乙酸乙酯(3136.85)、丙酸乙酯(28.35)、乙酸丙酯(30.59)、丁酸乙酯(444.93)、丙酸丙酯(218.57)、丁酸丙酯(19.92)、乙酸(3.26)、丙酸(15.98)、仲辛酮(7.29) 和2,4-二叔丁基苯酚(109.79)。NH样品中OAV最大的是乙酸乙酯(2 958.89)，其次是丁酸乙酯(351.06)、异戊醇(99.31)、2，4-二叔丁基苯酚(69.93)、丁酸丙酯(49.56)、二烯丙基硫醚(33.48)、正丁醇(25.51) 和仲丁醇(19.46)，这些物质对香气轮廓形成起决定性作用。MC样品中OAV最大的是乙酸乙酯(2 694.08)，其次是丁酸乙酯(411.64)、异戊醇(164.74)、丁酸丙酯(98.87)、2，4-二叔丁基苯酚(86.86)、正丁醇(44.31)、丁酸(29.24)和异辛醇(27.87)。

表2 不同米酸汤样品挥发性物质成分阈值及OAV
Table 2 Threshold and OAV of volatile component in different rice sour soup samples

注：挥发性物质阈值来自标注文献；“ / ”表示未能查找到相关阈值数据及进行OAV值计算；“-”表示未能检出

由于醇类和酯类物质挥发性较强，阈值较低，OAV较大，因此其对3种米酸汤样品风味都具有很大贡献，同时也是凯里米酸汤中重要的风味化合物。米酸汤中酯类物质可以给整体风味特征带来花果香，有助于改善香味复杂性[14]。其中乳酸乙酯具有水果和黄油的味道[14]；乙酸乙酯具有果香和洗甲水风味特征[15-16]，且在浓度低于150 mg/L时具有增强香气吸引力的作用[16]；丁酸乙酯具有香蕉和青苹果气味[16]。正丁醇具有酚类香气特征[16]；异戊醇具有动物皮毛和洗甲水风味特征[16-17]；正己醇具有青草香[16]；正丙醇会带来辛辣香味[16]。样品中还分析出少量酸类、醚类、酮类和酚类化合物，它们对凯里米酸汤风味形成具有一定的修饰作用。如乙酸具有醋味[16]，丁酸能增强酸败的气味[18]。

从表2还可以看出，米酸汤YM样品中，丁酸、乙酸丁酯、丁酸丙酯和丁酸丁酯含量比MC样品低，而丙酸、丙酸乙酯和丙酸丙酯含量比MC样品高。这些物质对香气轮廓形成起重要作用，且可能提示不同米酸汤样品中发酵微生物代谢产酸类型不相同。前人研究发现，米酸汤发酵过程中存在乳酸菌、醋酸菌、毕赤酵母菌等触发的多种发酵形式，影响了酸汤有机酸代谢和风味特征[1-2]。

2.2 凯里米酸汤HS-GC-IMS分析结果

2.2.1 不同米酸汤样品挥发性成分差异

利用HS-GC-IMS分析3个具有代表性米酸汤企业产品挥发性成分，根据挥发性成分的物质峰保留时间、迁移时间及物质峰强度可以生成三维图谱。三维图谱经投影后获得的二维俯视图如图1所示。选取米酸汤MC样品气味指纹图谱作为参比，其他两种样品图谱扣除参比。图1中白色部位表示挥发性成分浓度与参比样品相同，红色代表该成分浓度高于参比样品，蓝色代表该成分浓度低于参比样品。每个样品的图谱代表其顶空中所有挥发性成分。由图1及方框指示位置可知，从左至右依次显示的MC、NH和YM米酸汤样品挥发性成分差异明显。

图1 不同米酸汤样品挥发性物质成分二维气相 离子迁移图谱
Fig.1 Two-dimensional GC-IMS image of different rice sour soup samples 注:纵坐标为保留时间，横坐标为迁移时间，红色竖线为反应离子峰

2.2.2 不同米酸汤样品挥发性成分HS-GC-IMS定性分析

利用外标正酮C4～C9计算挥发性物质保留指数，与GC-IMS内置NIST、IMS数据库信息进行定性比对，结果见表3。3种米酸汤样品中共定性识别出33种挥发性物质成分，包括6种醇类、14种酯类、5种醛类、4种酮类、3种酸类、1种呋喃类。由于内置数据库正在完善中，因此图1中部分挥发性物质成分未能识别。

表3 米酸汤样品GC-IMS图谱挥发性物质成分定性结果
Table 3 Qualitative result of volatile component in the GC-IMS image of rice sour soup samples

2.2.3 不同米酸汤样品挥发性成分指纹图谱分析

利用GC-IMS的Gallery Plot插件比对不同米酸汤样品挥发性成分物质含量差异，利用所有样品二维图谱待分析峰构建指纹图谱(图2)。从图中可以直观识别每种样品完整挥发性成分信息以及样品间挥发性成分物质含量差异。

从指纹图谱中可知，不同米酸汤样品有共同的挥发性物质成分和各自的特征物质峰。凯里米酸汤样品共同含有的挥发性物质成分主要包括乙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酸乙酯、乙醇、正丙醇、正丁醇、异丁酮等7种。米酸汤MC样品的主要特征物质包括乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸丙酯、己酸甲酯、异丙醇、正戊醇、3-戊酮等10种;米酸汤NH样品的主要特征物质包括异辛醇、2-乙基呋喃、丁酸乙酯、乙酸异丙酯、甲酸乙酯、乳酸乙酯、E-2-己烯醛、2,3-戊二酮、丙酮等9种，米酸汤YM样品的主要特征物质包括异丁酸、丙酸、正丁醛、乙酸丁酯等4种。从指纹图谱中还发现3种未能定性的挥发性物质成分，这是由于GC-IMS内置NIST数据库信息限制导致。凯里米酸汤主要酿造原料为本地产禾糯米，含有淀粉、氨基酸、B族维生素、脂肪酸等，发酵前需要将原料进行高温蒸煮[20]。前人研究认为：脂肪酸酶解之后可以产生挥发酸，带来水果、脂肪、奶酪和酸败的味道，而醋酸酯可以由乙酰辅酶A和醇通过一系列反应代谢产生[18]。醇类物质代谢产生途径包括氨基酸的降解、不饱和脂肪的降解或醛类物质还原反应[16]，而酯类挥发性物质一般通过酸和醇的脱水-缩合反应形成[21]。样品中检测到的2-乙基呋喃属杂环化合物，可以通过糖裂解、硫胺素降解及美拉德反应产生[12]。

图2 不同米酸汤样品挥发性物质成分指纹图谱
Fig.2 Volatile component fingerprint of different rice sour soup samples 注：Y轴为样品编号；X轴为米酸汤样品全部挥发性成分物质信号峰；已定性物质用名称表示；未定性物质用编号表示； 物质峰颜色越深代表相对含量越大

2.2.4 不同米酸汤样品挥发性成分主成分分析

为直观比较3种代表性凯里米酸汤产品挥发性成分差异，使用Dynamic PCA插件程序制作主成分分析图，结果见图3。PC1和PC2的贡献解释了总变异的98%，且3种米酸汤样品能很好分离，证明了样品特征性风味物质具有一定差异。选取所有样品的挥发性成分物质峰进行主成分分析，其中分布在主成分分析图右下角黑色圆点为MC样品，样本间聚集度较高；左下角蓝色圆点为NH样品，样本间聚集度一般；上方中间位置红色圆点为YM样品，样本间聚集度较均匀。GC-IMS技术可对不同凯里米酸汤产品进行有效区分。

图3 不同米酸汤样品主成分分析结果
Fig.3 Principal component analysis of different rice sour soup samples

2.3 米酸汤样品挥发性成分HS-SPME-GC-MS和GC-IMS分析差异

表1和表3分别列出HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS鉴定出的3种代表性米酸汤产品主要挥发性物质成分28种和33种。通过比对发现，2种分析技术共同检测出的挥发性物质成分为13种，多为醇、酯、酸类等化合物。3种米酸汤样品在2种检测方法中都检出乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、丁酸乙酯、丁酸丙酯、乳酸乙酯、乙醇和丙酸8种风味物质；MC和NH米酸汤样品在2种检测方法中都检出正丁醇、异丙醇、异辛醇3种风味物质；MC米酸汤样品在2种检测方法中都检出乙酸丁酯、正丙醇2种风味物质。通过对比还可以发现，米酸汤样品中只被HS-GC-IMS鉴定出的挥发性物质为己酸甲酯、乙酸异戊酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸异丁酯、2-甲基丁酸甲酯、乙酸异丙酯、甲酸乙酯、正戊醇、2-甲基丁醛、丙醛、2-己烯醛、正丁醛、糠醛、异丁酮、2,3-戊二酮、丙酮、3-戊酮、2-乙基呋喃、异丁酸和2-甲基丁酸。只被HS-SPME-GC-MS鉴定出的挥发性物质为丙酸丙酯、领苯二甲酸二丁酯、仲丁醇、异戊醇、正己醇、2-壬醇、苯乙醇、仲辛酮、2-甲基呋喃、二烯丙基硫醚、乙二醇乙醚、乙酸、丁酸、2,4-二叔丁基苯酚。2种分析方法中，GC-IMS鉴定出相对更丰富的酯类、醛类、酮类化合物。这可能是由于其前处理条件以及GC-IMS的2次分离效果，导致GC-IMS结果中特异性挥发物质总数增加[12]。采用2种技术手段协同分析，可以获得3种凯里米酸汤中更加全面的挥发性风味物质成分信息。

3 结论

为研究凯里米酸汤3个代表性产品挥发性风味物质特征，采用顶空固相微萃取-气质联用和顶空气相色谱-离子迁移谱两种技术方法对其进行分离鉴定。采用HS-SPME-GC-MS技术分析出28种挥发性物质。与米酸汤MC样品比较，YM样品中，丁酸、乙酸丁酯、丁酸丙酯和丁酸丁酯含量较低，而丙酸、丙酸乙酯和丙酸丙酯含量较高。不同厂家米酸汤产品有机酸及其衍生挥发性物质组成差异显著。下一步可以研究凯里米酸汤发酵微生态环境条件参数对优势菌株及其代谢产生主要挥发性物质动力学规律影响，以提升产品品质特征。采用HS-GC-IMS技术分析出33种挥发性成分，其中13种挥发性成分与GC-IMS鉴定结果一致。由于GC-IMS对挥发性物质的高分离特性，同时应用HS-GC-IMS和HS-SPME-GC-MS技术可以获得米酸汤挥发性成分更完整的信息。GC-IMS指纹图谱表明：样品挥发性成分特征明显；主成分分析表明3种凯里米酸汤样品间风味差异大，并能分别聚成一类。GC-IMS技术可以有效识别不同来源米酸汤产品，但该分析结果中部分挥发性物质成分尚未能够被定性。因此，下一步有必要将HS-GC-IMS应用于SPME技术并继续完善NIST和IMS数据库信息，以提高其利用价值与应用范围。