乳酸菌食品中污染菌的计数和MALDI-TOF MS鉴定

乳酸菌是一类利用可发酵的碳水化合物产生大量乳酸的细菌，从分类学上看，乳酸菌至少包含了乳杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属、芽胞杆菌属等23个菌属[1]。有关乳酸菌提高营养物质利用率、预防和治疗疾病、调节机体的免疫力等益生功能已有很多报道[2]，最新的研究发现，乳酸菌还可通过“脑肠轴”对行为模式进行调节[3]。除了用于生产发酵乳，为改善产品风味等原因，乳酸菌也广泛添加在饮料、奶粉、饼干、糖果等食品中[4-9]。

在食品安全国家标准中，对乳酸菌食品质量安全的关注点，主要集中在两方面：一是乳酸菌的含量。由于乳酸菌必须达到一定的数量才能发挥益生作用，因此在GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》、GB 10765—2010《食品安全国家标准 婴儿配方食品》和GB 7101—2015《食品安全国家标准 饮料》中均规定，乳酸菌的含量不得小于106 CFU/mL(g)。二是乳酸菌食品的污染菌，包括菌落总数、大肠菌群、霉菌酵母等指示菌，以及沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌。在含乳酸菌食品的国家标准中，对菌落总数的规定存在较大差异。因为产品中存在活的乳酸菌，进行菌落总数测定时，一些乳酸菌会在平板计数琼脂上生长，而对菌落总数结果造成干扰，发酵乳和饮料的食品安全国家标准因此没有设置菌落总数的限量。然而，有些标准如GB 10765—2010，基于菌落总数测定是在有氧条件下进行的，对添加了厌氧乳酸菌的产品，又规定了菌落总数的限量。这些标准的差异，对乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌的计数造成了较大的困扰。一方面，食品安全国家标准对食品中添加的菌株是否为厌氧菌的判断，没有具体规定；另一方面，为保持双歧杆菌等厌氧菌的高活性并发挥益生功效，一些菌剂的生产厂商对双歧杆菌进行了耐氧驯化[10]，使得一些传统上认为是厌氧的乳酸菌，在有氧的条件下也能生长。因此，须从计数平板上排除乳酸菌的干扰，只是特异性针对非乳酸菌等污染菌进行计数。

对计数琼脂上菌落的鉴定，以迅速准确区分乳酸菌与非乳酸菌，是乳酸菌食品中污染菌计数的又一难点。采用传统的生物化学方法鉴定乳酸菌，操作繁琐且准确性低[11]；近来兴起的一些分子生物学方法检测乳酸菌，如PCR法、16S rDNA/rRNA基因序列分析法、变性梯度凝胶电泳法等等，但都要采用特定的引物或探针，针对特定菌进行检测，并不适合对未知菌的鉴定[12-15]，变性梯度凝胶电泳法等方法还要对PCR产物进行后处理[16]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是近年来发展起来的一种用于蛋白质、多肽等生物大分子鉴定的新技术，其原理是将待测菌与基质混合后，用激光轰击电离，根据到达检测器的时间及离子的数量，绘制横轴为质荷比m/z、纵轴为峰强度值的图谱，与数据库中的图谱进行比对后对微生物进行鉴定[17]，整个操作过程只需1 h便有检测结果。该方法具有操作简单、速度快、成本低、通量高的特点，而且鉴定前无需进行革兰氏染色，还可用于芽胞菌、霉菌、酵母的快速鉴定，特别适用于未知菌的鉴定。

因此，本文参考ISO 13559:2002—Butter, fermented milks and fresh cheese—Enumeration of contaminating microorganisms-Colony-count technique at 30 ℃，使用不含糖的计数琼脂 (count agar sugar free，CASF)，对含活乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌进行计数；同时按照食品安全国家标准GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》、GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》的方法，分别对乳酸菌食品中的乳酸菌、菌落总数进行计数。并采用MALDI-TOF MS法对CASF和平板计数琼脂(plate count agar，PCA)平板上的菌落进行鉴定，以迅速区分乳酸菌与非乳酸菌，探讨适合乳酸菌食品中污染菌的计数方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

INE800型恒温培养箱，德国MEMMERT公司；MARK Ⅱ厌氧培养系统，荷兰ANOXOMAT公司；VITEK MS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，法国生物梅里埃公司。

MRS琼脂(批号190124)、PCA(批号201203)，北京陆桥技术股份有限公司；CASF(批号VM913678011)，MERCK公司；CHCA基质液(批号1008255570)，法国生物梅里埃公司；大肠埃希氏菌ATCC 8739，Microbiologics。

动物双歧杆菌Bb-12菌粉、乳双歧杆菌菌粉、保加利亚乳杆菌菌粉、德氏乳杆菌菌粉、嗜热链球菌菌粉、长双歧杆菌菌粉，呼和浩特市某乳酸菌粉厂；国产和进口含活乳酸菌的固体饮料10份、发酵乳2份，市售。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌、非乳酸菌、菌落总数计数

无菌取25 g样品置于装有225 mL无菌生理盐水的均质袋中，均质2 min，选取2～3个合适的稀释度，每个稀释度各吸取0.1 mL样品匀液涂布于CASF琼脂表面，30 ℃需氧培养72 h；同时吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿中，倾注MRS琼脂培养基， 36 ℃厌氧培养72 h；另外吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿中，倾注PCA培养基，36 ℃需氧培养48 h。每个稀释度做2个平行，15 min内完成从样品稀释到平皿倾注。每个样品重复3次实验。

1.2.2 菌落鉴定

将待鉴定菌落划线于血平板36 ℃培养24 h，或接种在MRS平板后36 ℃厌氧培养72 h，挑取培养物的单个菌落涂布至靶板孔，立即加入1 μL CHCA基质液；同时挑取质控菌株大肠埃希氏菌ATCC 8739纯培养物涂布至质控孔，立即加入 1 μL CHCA基质液；干燥后，用VITEK MS进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌粉的计数结果及分析

由表1数据可见，6种乳酸菌菌粉在MRS平板上生长良好，乳酸菌计数结果与其标称的数量一致。在有氧条件下培养的PCA和CASF平板上，未见菌落生长，表明这6种乳酸菌在PCA琼脂上不生长，菌粉也没有受到非乳酸菌的污染。

表1 乳酸菌粉的计数结果 单位：CFU/g

Table 1 Enumeration results of lactic acid bacteria in starter powders

2.2 市售含乳酸菌食品的计数和鉴定结果及分析

从表2可知，市售的10种固体饮料和2种发酵乳的乳酸菌计数结果均大于106 CFU/g，表明这些食品中乳酸菌含量符合相关标准GB 7101—2015和GB 19302—2010的要求。而这些乳酸菌食品的PCA和CASF的计数和菌落鉴定结果大致有以下5种情况。

表2 市售乳酸菌食品的计数及鉴定结果 单位：CFU/g

Table 2 Enumeration and identification of commercial foods containing lactic acid bacteria

(1)PCA上既有较多细小的菌落，又有少量较大的菌落(图1-a)，CASF上少量的菌落都比较大(图1-b)，如样品1。PCA上细小的菌落，MALDI-TOF MS鉴定为凝结芽胞杆菌，是样品标称添加的乳酸菌。PCA和CASF上较大的菌落，鉴定为蜡样芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌，属于污染菌。

a-PCA; b-CASF
图1 固体饮料GS在不同培养基上的菌落
Fig.1 Colonies of solid beverage GS on different agar plates

(2)PCA和CASF少量的菌落都比较大，如样品2。PCA和CASF上较大的菌落，鉴定为地衣芽胞杆菌和克劳氏芽胞杆菌，属于污染菌。

(3)PCA上有较多细小的菌落，CASF上少量的菌落都比较大，如样品3和样品4。PCA上细小的菌落，MALDI-TOF MS鉴定为干酪乳杆菌(图2)，是样品标称添加的乳酸菌。CASF上较大的菌落，鉴定为蜡样芽胞杆菌(图3)，属于污染菌。样品11的菌落鉴定结果也是如此。

图2 干酪乳杆菌的MALDI-TOF MS图谱
Fig.2 Mass spectrum of L. casei

图3 蜡样芽胞杆菌的MALDI-TOF MS图谱
Fig.3 Mass spectrum of B. cereus

(4)PCA和CASF上均未见菌落生长，如样品5～样品8。

(5)PCA上有较多细小的菌落， CASF上未见的菌落生长，如样品9、10、12。PCA上细小的菌落，MALDI-TOF MS鉴定结果属于乳酸菌。

对以上乳酸菌食品的计数和鉴定结果的分析发现，由于某些乳酸菌可在PCA上形成细小的菌落，因此不宜用菌落总数测定来计数乳酸菌食品中的污染菌。然而CASF上的菌落，经鉴定均不是样品标称添加的乳酸菌，而是蜡样芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌等污染菌，CASF可以用来计数乳酸菌食品中的污染菌。

3 结论与讨论

由于乳酸菌的益生功能，乳酸菌现已被广泛添加到许多食品中，含乳酸菌食品的质量安全也受到广泛关注[18-19]。乳酸菌食品中污染菌的数量，也是指示乳酸菌食品加工过程卫生状况的重要指标之一，但是乳酸菌食品中污染菌计数的难度较大，导致乳酸菌食品菌落总数限量的设置和结果判断分歧较大。

乳酸菌食品中污染菌计数的难点之一，是缺乏特异性的计数琼脂。近来有研究根据乳酸菌需要利用糖类以及适宜酸性生长环境的特性，采用pH为8.0且不含糖的计数琼脂CASF，对乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌进行计数[20]。本文采用这一方法，对12种市售乳酸菌食品中污染菌计数发现，该琼脂可排除样品中乳酸菌的干扰，并特异性计数乳酸菌食品中非乳酸菌等污染菌。

本文采用PCA和CASF平板，对乳酸菌食品菌落总数的计数结果进行比对，并利用MALDI-TOF MS技术对未知菌的快速鉴定优势，对PCA和CASF平板上的菌落进行快速准确鉴定，达到迅速区分乳酸菌与非乳酸菌的目的。本文发现，采用CASF计数，结合MALDI-TOF MS鉴定技术，可迅速准确地对乳酸菌食品中污染菌进行计数和鉴定。