沃柑中4种常用杀虫杀螨剂的残留分析及膳食风险评估

沃柑(Citrus reticulata)果实色泽艳丽，果肉细嫩多汁，营养品质和口感风味上乘[1]，其为‘坦普尔’橘橙与‘丹西’红橘的杂交种，育成于以色列，后引入中国重庆、广西、云南等地[2]。因货架期长，栽培效益高，近年来成为我国发展极为迅速的晚熟杂柑品种之一。目前，仅广西的种植面积已超10万hm2[3]，已成为我国南方地区农民增收、农业增效和农村经济发展的重要支柱产业，在农业产业供给侧结构调整、精准扶贫和乡村振兴中发挥了重要作用。然而，沃柑生长发育周期长，易遭受多种多代病虫害侵袭，加上生长环境高温潮湿，果园年平均用药次数多达26.5次，平均每次用药3种以上[4]。在国家柑橘类水果质量安全监测和国家市场监督管理总局抽检中，沃柑等晚熟柑橘多次出现农药残留超标情况，特别是常用杀虫杀螨剂超标较多[5]，其质量安全状况受到高度关注。

沃柑生产中常见虫害有红蜘蛛、潜叶蛾、木虱、蚧壳虫等[2]，三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和联苯菊酯等杀虫杀螨剂长期以来被广泛用于防治这些虫害爆发。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)的分类标准，三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和联苯菊酯分别被划分为Ib类、II类、II类和II类毒性化合物[6]，对人体健康具有潜在危害。因此欧盟对柑橘中三唑磷、丙溴磷、毒死蜱的最大残留限量值(maximum residue limit，MRL)均规定为0.01 mg/kg，远严格于我国[7]。毒死蜱是柑橘中检出率最高的农药种类，三唑磷、丙溴磷和联苯菊酯超标率较高，是影响柑橘质量安全的主要风险因子，但丙溴磷、联苯菊酯和毒死蜱在早熟品种温州蜜柑上残留水平较低，可安全使用[5,8]。然而，这些杀虫杀螨剂在晚熟品种上残留超标率高，其残留消解状况与膳食风险如何，是否与早熟品种存在较大差异还未见报道。因此，本试验以沃柑为对象，采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测技术，分析三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和联苯菊酯在沃柑中的消解与残留分布，并对其可能产生的人群膳食风险进行评估，以期为我国沃柑安全生产、监测和消费引导提供重要的技术依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

三唑磷标准品(纯度≥97%)、丙溴磷标准品(纯度≥99%)、毒死蜱标准品(纯度≥99%)、联苯菊酯标准品(纯度≥99.5%)，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、甲醇(色谱纯)，美国Sigma-Aldrich 公司；乙酸铵(色谱纯)，德国Honeywell-Fluka公司；乙二胺基-N-丙基(PSA)，上海安谱科学仪器有限公司；MgSO4、NaCl(分析纯)，江苏强盛化工有限公司；试验用甲氰·三唑磷(22%乳油，柳州市惠农化工有限公司)、丙溴磷(50%乳油，青岛中达农业科技有限公司)、啶虫·毒死蜱(40%微乳剂，江西众和化工有限公司)、联苯菊酯(100 g/L乳油，安道麦辉丰(江苏)有限公司)，购于当地农资商店。

1.2 仪器与设备

LC-30AD超高效液相色谱仪，日本Shimadzu公司；QTRAPTM 6500三重四极杆线性离子阱复合质谱仪，美国AB SCIEX质谱系统公司；KQ5200DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；超纯水系统Milli-Q AdvantageA10，美国Millipore公司；CL31/CL31R多用途离心机，美国Thermo Fisher公司；CK 2000型高通量组织研磨仪，北京Thmorgan生物科技有限公司。

1.3 田间试验与样品采集

供试材料为沃柑，于2020年10月～2021年1月在南宁、贺州和重庆三地选择管理水平和树龄大体一致的结果盛期沃柑园进行。采用喷雾法对沃柑树进行农药喷施。其中，消解动态试验以所选农药最高推荐剂量的1.5倍液(三唑磷270 mg a.i./kg、丙溴磷375 mg a.i./kg、毒死蜱700 mg a.i./kg、联苯菊酯90 mg a.i./kg)为施药剂量喷药1次，并分别于喷药后0(2 h)、3、7、14、21、28、35、45、60 d按随机法进行果实样品采集；最终残留试验按良好农业规范，以所选农药的最高推荐剂量(三唑磷180 mg a.i./kg、丙溴磷250 mg a.i./kg、毒死蜱467 mg a.i./kg、联苯菊酯60 mg a.i./kg)进行喷施，三唑磷和丙溴磷2次、毒死蜱1次、联苯菊酯3次，并分别于各自的安全间隔期及安全间隔期后7或10 d各采样1次。三唑磷的安全间隔期为30 d，丙溴磷和毒死蜱为28 d，联苯菊酯为14 d。以4株沃柑树为1个试验小区，每个处理重复3次，以清水喷施为对照。每个处理采样不少于2 kg，样品采集标号后，置于加冰保温盒中运至实验室。分别处理样品全果、果皮和果肉，用匀浆机对样品进行匀浆，于-20 ℃冷冻保存，待测。

1.4 试验方法

1.4.1 样品前处理

采用QuEChERS方法对样品进行提取净化：称取沃柑果实样品5.00 g于50 mL离心管中，加入10.00 mL乙腈，垂直振荡提取10 min，加入2.00 g MgSO4和0.50 g NaCl，垂直振荡1 min后，10 000 r/min离心5 min。移取1.50 mL上清液加入装有50 mg PSA的4 mL离心管中，涡旋1 min，以4 000 r/min离心5 min，取上清液经0.22 μm有机滤膜过滤，上机检测。

1.4.2 标准工作液的配制

分别准确称取约10.0 mg农药标准品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容。取相应量的单标储备液于100 mL容量瓶中，用乙腈配制成10 mg/L的标准混合储备液，-18 ℃避光保存备用。使用时，将标准混合储备液稀释至质量浓度为1、2、5、10、20、50、100、200 和500 μg/L的系列溶剂标准溶液；同时将标准混合储备液用处理后的沃柑果实、果皮和果肉提取液稀释至相同质量浓度的系列基质匹配标准溶液用于定量，4 ℃下保存。

1.4.3 色谱条件

色谱柱：ACE Excel 2 C18(100 mm×2.1 mm，2 μm)；柱温：40 ℃；进样量：1.0 μL；流速：0.4 mL/min；流动相 A：5 mmol/L乙酸铵水溶液；流动相 B：甲醇。梯度洗脱程序：0～3 min，10% B～90% B；3～6 min，90% B；6～8 min，90% B～10% B。

1.4.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)；扫描方式：正离子扫描；监测模式：多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)；离子源温度：500 ℃；电压5 500 V(ESI+)/-4 500 V(ESI-)；雾化气(GS1)压力：379.2 kPa(55 psi)；辅助气(GS2)压力：379.2 kPa(55 psi)；气帘气压力：275.8 kPa(40 psi)。MRM质谱参数见表1。

1.5 降解动态方程

按照一级反应动力学方程拟合4种杀虫杀螨剂在沃柑中的残留降解动态，消解系数K通过公式(1)计算，半衰期通过公式(2)计算。

CT=C0e-KT

(1)

(2)

式中：CT，T时间目标农药的残留浓度，mg/kg；C0，施药后目标农药的初始沉积量，mg/kg；K，消解系数；T1/2，降解半衰期，d；T，施药后时间，d。

表1 4种杀虫杀螨剂的质谱条件参数和结构
Table 1 UPLC-MS/MS parameters and chemical structures for the four insecticides and acaricides

注：标*为定量离子

1.6 膳食风险评估

根据WHO规定的方法[9]，沃柑中农药残留慢性膳食风险(%ADI)按公式(3)(4)计算，急性膳食风险(%ARfD)按公式(5)(6)计算，风险值<100时，健康风险在可接受范围内；而风险值>100时，存在不可接受的健康风险。

EDI=(STMR×F)/bw

(3)

%ADI=EDI/ADI×100

(4)

(5)

%ARfD=ESTI/ARfD×100

(6)

式中：EDI，每日估计摄入量，mg/kg bw；STMR，农药残留试验中值，mg/kg；F，柑橘人均消费量，kg；bw，人群体重，kg；ADI，每日允许摄入量，mg/kg bw，源自WHO数据库[10]；ESTI，短期估计摄入量，mg/kg bw；Ue，单果重，kg；HR，最终残留试验得到的最高残留浓度，mg/kg；v，变异因子；LP，柑橘消费大份餐，kg；ARfD，急性参考剂量，mg/kg bw，源自WHO数据库[10]。不同人群体重与沃柑消费数据等来源于WHO统计数据[11]。

2 结果与分析

2.1 方法验证

如表2所示，在1～500 μg/L质量浓度范围内，所选农药的线性相关系数在0.993 7～0.999 8(r>0.99)，线性良好。以满足农残分析回收率要求的最低添加浓度为方法定量限(limit of quantitation，LOQ)，LOQs确定为10 μg/kg，低于目标农药的MRL。沃柑果实和果肉中按0.01、0.1、2 mg/kg，果皮中按0.01、0.1、10 mg/kg 3个浓度水平进行添加回收实验，每个添加浓度重复6次，结果表明，在3个加标水平下，4种杀虫杀螨剂在3种基质中的回收率为74.1%～100.6%，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)在0.5%～13.5%，该方法具有良好的准确度和精密度，根据农作物中农药残留试验准则(NY/T 788—2018)，可满足所选农药残留检测分析要求。4种杀虫杀螨剂的 UPLC-MS/MS 色谱图见图1。

2.2 沃柑中4种常用杀虫杀螨剂的降解动态曲线

三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和联苯菊酯在晚熟柑橘沃柑中的残留消解动态变化曲线如增强出版附件所示。按试验剂量喷施4种杀虫杀螨剂2 h后，三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和联苯菊酯在3个产地沃柑上的初始沉积量分别为435.0～726.2 μg/kg、573.7～689.2 μg/kg、817.5～1 525 μg/kg和91.8～113.2 μg/kg，消解曲线决定系数(R2)为0.874 8～0.989 2，指数关系良好，消解规律均符合一级动力学方程。施药60 d时，三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和联苯菊酯在沃柑上的消解率分别达到73.6%～83.6%、77.7%～85.5%、92.1%～96.2%和83.4%～88.3%，半衰期分别为21.7～30.1 d、22.4～28.9 d、13.9～15.4 d和19.8～24.8 d。与其他作物相比，4种农药在沃柑中的消解速度较慢[12-13]，在果实中的持久性除毒死蜱较低之外，其他3种均中等[14]。这个结果除与当地环境条件和农药剂型等因素有关外[15-16]，很大程度上还与施药时期及柑橘果皮的特殊结构有关。王思威等[17]在柑橘幼果期施用丙溴磷，半衰期为4.3～7.2 d，显著短于本试验结果。有些农药在柑橘类水果中的消解速率和半衰期比在其他作物上更慢和长[15,17-19]，柑橘表皮的蜡质层及丰富的精油囊胞可能会使农药的降解受阻，使其半衰期延长[19-20]。

表2 四种杀虫杀螨剂的线性、定量限、回收率和相对标准偏差
Table 2 The linearity, LOQs, recoveries and RSDs for the four insecticides and acaricides

a-果实；b-果皮；c-果肉
图1 添加浓度为10 μg/kg时沃柑不同部位 中4种农药的总离子流色谱图
Fig.1 Total ions chromatogram of the four pesticides in different parts of Orah mandarin at 10 μg/kg spiking concentration

2.3 沃柑中4种常用杀虫杀螨剂的最终残留

目前，我国柑和橘中三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和联苯菊酯的MRL分别规定为0.2、0.2、1和0.05 mg/kg，沃柑中三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和联苯菊酯的最终残留试验结果如表3所示。按推荐剂量施药，3个试验点沃柑果实中三唑磷、丙溴磷和联苯菊酯在其安全间隔期及安全间隔期后采样检测的平均残留量分别为0.451～0.773和0.410～0.659 mg/kg、0.485～0.596和0.247～0.539 mg/kg、0.155～0.259和0.123～0.274 mg/kg，均没有降解到其MRL以下；毒死蜱在其安全间隔期及安全间隔期后7 d的平均残留量为0.155～0.722和0.133～0.563 mg/kg，均在其MRL以下。可见，丙溴磷、三唑磷和联苯菊酯在晚熟柑橘品种沃柑上降解缓慢，按推荐剂量和安全间隔期使用后在沃柑果实中残留量容易超标，这可能是市场监测中这些农药检出超标的原因之一。毒死蜱检出率虽高，但鲜有超标。与王思威等[17]研究结果相同，说明丙溴磷等农药在柑橘幼果期施用是安全的，但在10月果实转色期之后施用容易超标。另外值得指出的是，虽然沃柑果实中丙溴磷、三唑磷和联苯菊酯的残留量较高，但果肉均未检测到农药残留，果皮中4种农药残留量为果实中的3.1～6.5倍，残留主要集中在果皮中，这与前人相关研究结果基本一致[17, 21]。

2.4 沃柑中4种常用杀虫杀螨剂的膳食风险

开展膳食风险评估是农产品质量安全评价的有效手段。沃柑为皮不可食水果，但国际上通常是监测整个产品中危害物含量结合膳食摄入数据进行风险评估。近年来，加工因子引入用于风险评估研究使得评估结果更切合实际[18,22-23]。本研究针对沃柑整个果实和去皮后果肉中农药残留状况，分别评估一般人群和儿童的膳食风险。按照WHO规定，风险评估中低于LOQ的数据按1/2 LOQ进行处理[9]。沃柑果实中三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和联苯菊酯残留对我国消费者的潜在膳食风险见表4。4种杀虫杀螨剂对我国儿童和一般人群的慢性膳食风险在0.55～46.0，表现为三唑磷>毒死蜱>丙溴磷>联苯菊酯，均在可接受范围内；急性膳食风险为1.57～4 439，表现为三唑磷>联苯菊酯>毒死蜱>丙溴磷，其中三唑磷残留量对儿童和一般人群以及联苯菊酯残留量对儿童的风险值超出了可接受范围，有潜在急性健康风险。

表3 四种杀虫杀螨剂在沃柑上的最终残留量
Table 3 Final residues of four insecticide and acaricides in Orah mandarin

表5展示了沃柑果肉中三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和联苯菊酯残留对我国消费者的实际膳食风险。去皮能够显著降低农药残留膳食风险[18, 24]，4种杀虫杀螨剂的慢性和急性风险分别为0.005～0.50和0.013～28.6，均远远低于安全界限100。因此，沃柑作为鲜食水果去皮食用时，4种农药残留对人体的健康风险可忽略不计。若考虑加工食用整个果实或果皮产品时，具有一定的急性膳食摄入风险，且对儿童风险更高，不建议进行消费[21,24]，皮渣利用时也应结合产品用途考虑农药残留的影响。

表4 沃柑果实中4种杀虫杀螨剂残留对我国消费者的潜在膳食风险
Table 4 Potential dietary risks of insecticides and acaricides in Orah fruits for Chinese consumers

表5 沃柑果肉中4种杀虫杀螨剂残留对我国消费者的膳食风险
Table 5 Dietary risks of insecticides and acaricides in Orah pulp for Chinese consumers

3 结论

采用QuEChERS结合UPLC-MS/MS方法对沃柑中4种常用杀虫杀螨剂进行检测，结果表明该方法具有良好的准确度和精密度，可满足试验农药残留检测分析要求。4种杀虫杀螨剂在沃柑上的消解规律符合一级动力学方程，但降解速率较慢，在果实中的最终残留只有毒死蜱可降解到其MRL以下，三唑磷、丙溴磷和联苯菊酯均超出其各自的MRL。4种农药残留主要集中在果皮中，果皮中的残留量为果实中的3.1～6.5倍。沃柑果肉中4种农药残留对人体的健康风险可忽略不计，但整个果实中残留的三唑磷对儿童和一般人群以及联苯菊酯对儿童的急性膳食摄入风险值超出了可接受范围，存在急性健康风险。果实转色期后应停止使用三唑磷、丙溴磷和联苯菊酯，同时，不建议对沃柑整个果实或果皮产品进行加工食用。