四川黑茶渥堆过程中主要品质成分和茶汤色差变化及其相关性研究

黑茶是我国6大茶类之一，是加工过程中有微生物参与品质形成的后发酵茶，主要产于湖南、云南、四川等地。目前四川保留的传统黑茶花色主要是康砖和金尖两类边销藏茶，其在原料嫩度上有所区别。近年来，基于“藏茶汉饮”的市场需求，以及人们对黑茶健康作用的认识和消费需求，很多企业大量生产了用于满足非藏族地区消费的新工艺黑茶，如邛崃黑茶。传统四川黑茶工艺较繁琐，最多的要经过18道工序，经过茶叶工作者的不断改进，结合市场需求及茶叶加工技术的发展，其工艺已大为简化，现阶段一种主流做法是采用绿毛茶干坯渥堆，鲜叶经杀青、揉捻、干燥后制得绿毛茶，存放一段时间，再经一次性渥堆发酵到位，再干燥制成黑毛茶。

黑茶初制加工中，有一道特殊的“渥堆”工序，在微生物及其他化学反应的共同参与下，茶叶中的黄酮类、多酚类、生物碱类等具有刺激性、收敛性的物质发生了深度的氧化、聚合、水解，造就了黑茶独特的品质特征[1]。四川农业大学研究人员对传统四川黑茶渥堆过程中主要品质成分、酶类活性变化及感官品质进行了初步研究[2-6]。

茶叶色泽包括干茶色泽、汤色、叶底色泽3部分，是茶叶品质的重要组成部分。同时，茶叶色泽与茶叶品质存在着一定的关系，尤其是茶汤色泽与茶叶内含成分之间存在一定的相关性，黄酮醇及其苷类、儿茶素氧化产物被认为是影响绿茶茶汤的主要呈色物质[7]，因此茶汤色泽的测评在茶叶品质的评价中起着重要作用。用于色泽评定的现代仪器分析主要是色差分析，主要依靠均匀颜色空间表征食品色泽属性。色差分析在红茶加工及产品品质评价方面有较多应用，如分析不同红茶品质[8]、评价红茶汤色亮度[9]、监测红茶萎凋及发酵等[10-13]，此外色差分析还应用到绿茶、黄茶及乌龙茶的品质评价中[14-16]，但应用到黑茶渥堆过程中茶汤色差的评价中还鲜见报道。

本文对四川黑茶干坯渥堆95 d过程中主要品质成分变化进行了分析，探明其变化规律，同时采用色差分析方法，结合数理统计探讨了渥堆过程中茶汤色泽变化及其与主要品质成分之间的相互关系，并建立了茶汤色差值与主要品质成分的多元线性回归方程，以期为四川黑茶渥堆过程中品质形成机理的深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

渥堆过程样品，四川省雅安义兴藏茶有限公司，取样时间2019年6月14日～2019年9月18日。

乙腈、甲酸、甲醇(均为色谱纯)、咖啡碱、儿茶素标准品包括表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)、表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、表儿茶素(epicatechin，EC)、儿茶素(catechin, C)及标准品杨梅素-3-半乳糖苷等，美国Sigma公司。其他试剂药品均为分析纯。

1.2 仪器与设备

QUINTIX224-1CN电子天平，德国赛多利斯科学仪器有限公司；HH-S电子恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司；HPLC-20 AD高效液相色谱仪、UV-2550紫外-可见分光光度计，日本岛津公司，PFX-i Series spectro Colormeter高精度自动分光色差仪，英国Lovibond公司。超高效液相色谱-质谱系统由Agilent 1290超高效液相色谱(美国Agilent公司)串联Q Exactive Orbitrap高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)组成。所用色谱柱为UPLC HSS T3色谱柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)，美国Waters公司。

1.3 实验方法

1.3.1 四川黑茶加工工艺流程

鲜叶摊放→杀青→揉捻→炒干→陈放→渥堆→干燥。

渥堆堆高在1 m左右，当堆心温度升至60 ℃以上时，进行翻堆，翻堆频率约每周1次。

1.3.2 样品采集

每翻堆1次取1次样，采用5点取样法，取距堆表50 cm处的茶样，设3个重复，取样后立即用冰盒保存样品并带回实验室，供理化分析。取样包括渥堆0、7、13、20、27、34、41、48、55、61、69、76、83、95 d，共14个茶样。

1.3.3 主要生化成分测定

水浸出物、茶多酚、儿茶素总量、游离氨基酸含量测定参照国标GB/T 8305—2013、GB/T 8313—2018、GB/T 8314—2013；儿茶素组分、咖啡碱的测定采用HPLC方法[17]；茶黄素、茶红素、茶褐素含量测定采用系统分析法[18]；茶多糖总量测定参照蒽酮-硫酸法[19]。黄酮醇糖苷类化合物的测定参照王智聪等[20]及戴伟东等[21]方法进行，采用相对定量。

1.3.4 感官审评方法

参照GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》。

1.3.5 茶汤色差值测定

取3 g茶样，加沸蒸馏水150 mL冲泡5 min，趁热用滤纸过滤，滤液冷却至室温，用分光色差仪测定，3次重复。采用L、a、b色差系统进行测定，其中L值代表明度；a代表红绿色度，“+”代表红色程度，“-”代表绿色程度；b代表黄蓝色度，“+”代表黄色程度，“-”代表蓝色程度[9]。

1.4 数据统计分析

采用DPS 9.50软件进行方差及显著性分析、相关性分析、逐步回归与通径分析。采用Origin 9.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 四川黑茶渥堆过程中主要品质成分含量的变化

2.1.1 水浸出物含量变化

水浸出物是一切水可溶性物质的总和，对茶叶品质起决定性的作用。图1可以看出，在渥堆早期(0～7 d)，水浸出物含量显著增加，从40.83%增加到50.86%，增幅达24.57%，随后逐渐下降到第34天的47.27%，在渥堆中后期(34～61 d)水浸出物含量为46.7%～48.33%，随后显著降低至渥堆结束时的42.57%。整个渥堆过程水浸出物含量增加了4.26%。

图1 四川黑茶渥堆过程中水浸出物含量变化
Fig.1 Content of water extracts of Sichuan dark tea during post-fermentation 注：柱上不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)

在渥堆早期，微生物大量繁殖并通过分泌纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等以及湿热作用使水不溶性的纤维素、果胶、蛋白质等大分子物质降解为可溶性化合物，从而使水浸出物含量上升；但随着渥堆的进行，微生物继续大量繁殖，将分解的可溶性化合物作为碳源、氮源进行消耗，使水浸出物含量降低[4-5]。

2.1.2 游离氨基酸含量变化

氨基酸既是茶叶的呈味物质，又是茶叶香气的重要基质，对黑茶品质形成起着重要作用。由图2可知，在整个渥堆过程中，游离氨基酸含量呈下降趋势，但在某个时间段又保持相对稳定，直至渥堆结束，游离氨基酸含量下降了78.80%。

图2 四川黑茶渥堆过程中游离氨基酸含量变化
Fig.2 Contents of free amino acids of Sichuan dark tea during post-fermentation

在渥堆过程中，大量繁殖的微生物分泌胞外酶，将蛋白质水解，但整个过程中游离氨基酸并未得到积累，可能是因为微生物将氨基酸作为其生长所需氮源而利用消耗掉，同时，氨基酸与可溶性糖还可产生美拉德反应[3]。

2.1.3 咖啡碱含量变化

咖啡碱是茶叶中主要的嘌呤碱，是构成茶汤的重要滋味物质。图3可以看出，咖啡碱含量在渥堆前期(0～13 d)呈显著增加趋势，由2.91%增加到3.43%，增加了17.87%。在渥堆的第13～48天，其含量稳定在3.41%～3.47%，随后逐渐增加至渥堆结束时的3.60%。整个渥堆过程中，咖啡碱含量增加了23.71%。

图3 四川黑茶渥堆过程中咖啡碱含量变化
Fig.3 Contents of caffeine of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.1.4 茶多糖含量变化

茶多糖是茶叶中存在的一类具有多种生物活性的多糖复合物，大多为与蛋白质结合的酸性糖蛋白[22]。目前已有研究表明茶多糖具有降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗氧化、调节肠道微生态等多种生物功效[23-25]。图4可以看出，茶多糖含量在整个渥堆过程中呈波动上升趋势，直至渥堆结束，茶多糖含量显著增加3.51倍。茶多糖被认为是黑茶中重要的功能性成分之一，其含量在渥堆过程中大幅增加，是黑茶品质形成的重要保证。

图4 四川黑茶渥堆过程中茶多糖含量变化
Fig.4 Contents of tea polysaccharide of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.2 四川黑茶渥堆过程中多酚类物质及其转化产物含量的变化

2.2.1 茶多酚含量变化

茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称。由图5可以看出，在渥堆前期(0～27 d)，茶多酚含量稳定在14.15%～14.53%，随后逐渐下降至渥堆第41天的12.61%，在渥堆第41～61天，茶多酚含量稳定在12.40%～12.82%，随后又逐渐下降至渥堆结束时的9.60%。总体来说，整个渥堆过程，茶多酚含量呈下降趋势，降幅达32.4%。

图5 四川黑茶渥堆过程中茶多酚含量变化
Fig.5 Contents of tea polyphenols of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.2.2 儿茶素总量及组分含量的变化

结果表明(表1)，儿茶素总量及其组分在渥堆前55 d迅速下降，随后至第61天有一个短暂的回升，最后又迅速下降至渥堆结束时的低值。此时，样品中EGCG、EC、ECG、C含量已非常低甚至检测不出。在整个渥堆过程中，儿茶素总量、EGC、EC、EGCG和ECG分别下降96.60%、83.33%、93.90%、98.68%和99.17%。

茶叶中的儿茶素是多酚类物质的主体，因此，茶多酚含量的减少主要体现在儿茶素类物质含量的降低，这与其他学者研究结果一致[2-4]。而茶多酚含量的降低则主要归因于渥堆过程中茶多酚在微生物分泌的胞外酶及湿热作用下发生酶促和非酶促氧化、聚合及转化等系列反应[1]。

表1 四川黑茶渥堆过程中儿茶素总量及组分含量的变化 单位：%

Table 1 Contents of total catechin and component of Sichuan dark tea during post-fermentation

注：表中数据为3次重复的平均值±标准误，同一列中不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)

2.2.3 茶色素含量变化

茶黄素、茶红素、茶褐素是黑茶中多酚类物质的主要水溶性氧化产物，也是构成茶汤色泽及滋味的重要物质。图6-a、图6-b可以看出，茶黄素和茶红素含量在整个渥堆过程中均不同程度下降，至渥堆结束，分别下降53.55%、37.50%。但茶黄素和茶红素含量在渥堆过程中的某个时间段保持相对稳定，说明其进一步转化需要一定的过程及条件。茶褐素含量在渥堆的早期(至第7天)呈下降趋势，随后不断增加，直至渥堆结束含量达5.54%，增幅达110.65%(图6-c)。

在黑茶渥堆过程中，部分多酚类物质主要在多酚氧化酶的作用下氧化、聚合为茶黄素，茶黄素进而与双黄烷醇偶联氧化形成茶红素，最终促使茶褐素的形成[26]。

a-茶黄素；b-茶红素；c-茶褐素
图6 四川黑茶渥堆过程中茶色素含量变化
Fig.6 Changes of tea pigments contents of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.2.4 黄酮醇苷类物质含量的变化

茶叶中含有丰富的黄酮苷类物质，以黄酮醇苷为主，主要为槲皮素苷、杨梅素苷及山奈酚苷，其水溶液为绿黄色，被认为是绿茶汤色的重要组分[26]。如表2所示，在黑茶渥堆过程中主要检测出了8种黄酮醇苷，含量较高的有山奈酚-3-(6″-鼠李糖基)槐苷和杨梅素-3-半乳糖苷，除槲皮素-3-葡萄糖苷含量在渥堆结束后显著增加，黄酮醇苷总量及其他7个组分含量在渥堆结束后显著下降，且大多数黄酮醇苷在渥堆过程中呈现不断下降的趋势。

表2 四川黑茶渥堆过程中黄酮醇苷类物质含量的变化 单位：mg/kg

Table 2 Changes of flavone glycosides contents of Sichuan dark tea during post-fermentation

注：M-3-Ga：杨梅素-3-半乳糖苷；M-7-Rh：杨梅素-7-鼠李糖苷；M-3-Ne：杨梅素-3-新橘皮糖苷；Q-3-Ga：槲皮素-3-半乳糖苷；Q-3-G：槲皮素-3-葡萄糖苷；K-3-A：山奈酚-3-阿拉伯糖苷；K-7-(6″-gal)G：山奈酚-7-(6″-没食子酰)葡萄糖苷；K-3-(6″-rha)S：山奈酚-3-(6″-鼠李糖基)槐苷

2.3 四川黑茶渥堆过程中茶汤色泽的变化

表3可知，渥堆不同阶段茶汤色差值差异显著，随着渥堆的进行，L值逐渐降低，茶汤明度降低；a值由负向正逐渐升高，汤色由“绿”向“红”过度；b值波动升高，汤色黄色程度加深。感官审评显示，汤色由黄绿→绿黄→黄→橙黄→橙红→棕红→棕褐转变，明亮度也逐渐降低，感官审评与色差值契合较好。

表3 四川黑茶渥堆过程中茶汤色泽的变化
Table 3 Changes of tea soup color of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.4 四川黑茶渥堆过程中茶汤色差值与主要品质成分含量相关性分析

由表4可知，黑茶茶汤L值与氨基酸、茶多酚、茶黄素、茶红素、儿茶素、杨梅素-3-半乳糖苷、杨梅素-3-新橘皮糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、山奈酚-3-阿拉伯糖苷、山奈酚-7-(6″-没食子酰)葡萄糖苷、山奈酚-3-(6″-鼠李糖基)槐苷含量及黄酮醇苷总量呈极显著正相关，与咖啡碱、茶多糖、茶褐素及槲皮素-3-葡萄糖苷含量呈极显著负相关；而a值、b值与各成分含量的相关性则表现出与L值相反的结果。

2.5 主要品质成分对茶汤L、a、b值的逐步回归与通径分析

为了进一步分析四川黑茶渥堆过程中主要品质成分及色素含量对茶汤色差值影响，并找出影响茶汤色差值的主要因素，以L、a、b值为应变量，氨基酸含量X1(%)、茶多酚含量X2(%)、咖啡碱含量X3(%)、茶多糖含量X4(%)、茶黄素含量X5(%)、茶红素含量X6(%)、茶褐素含量X7(%)、儿茶素总量X8(%)、黄酮醇苷总量X9(mg/kg)为自变量进行逐步回归与通径分析，并建立了L、a、b值的多元线性回归方程。结果见表5～表7。

表4 L、a、b值与主要品质成分含量相关性分析
Table 4 Correlation analysis of L, a, b value and content of main quality components

注：*显著相关P<0.05；**极显著相关P<0.01

由表5可知，当考虑各内含成分之间的相互作用与交互关系时，茶黄素含量、茶红素含量、黄酮醇苷总量的增加可直接促进L值的增加；而氨基酸、茶褐素含量对L值的直接抑制作用较大，这些成分是直接影响L值的主要因素。此外氨基酸、茶黄素含量及黄酮醇苷总量通过影响茶红素及茶褐素含量进而对L值产生的间接影响作用也较显著。

表5 主要品质成分对茶汤L值的逐步回归与通径分析
Table 5 The stepwise regression and path analysis of the main quality components to the L value of tea soup

由表6可知，黄酮醇苷总量对a值的直接通径系数达到了-0.60，是抑制a值的最主要因素，此外，茶黄素含量对a值的直接抑制作用也较为显著，而茶褐素含量对L值的直接促进作用最为显著。因此，黄酮醇苷总量、茶黄素含量、茶褐素含量是直接影响a值的主要因素。此外，氨基酸、咖啡碱、茶黄素、茶褐素含量及儿茶素总量通过影响黄酮醇苷总量进而对a值产生的间接影响也不可忽视。

表6 主要品质成分对茶汤a值的逐步回归与通径分析
Table 6 The stepwise regression and path analysis of the main quality components to the a value of tea soup

表7显示，茶多糖含量、儿茶素及黄酮醇苷总量对b值的直接抑制作用较大，而茶褐素含量对b值的直接促进作用最为显著，这些成分是直接影响b值的主要因素。此外，一些物质通过影响茶多糖含量、儿茶素总量及黄酮醇苷总量进而对b值产生间接影响作用也不可忽视。

表7 主要品质成分对茶汤b值的逐步回归与通径分析
Table 7 The stepwise regression and path analysis of the main quality components to the b value of tea soup

3 讨论与结论

渥堆是四川黑茶品质形成的关键工序，在此进程中，茶叶中内含物质发生复杂的化学变化，形成四川黑茶滋味陈醇、汤色红浓明亮的品质特征。渥堆有湿坯渥堆和干坯渥堆2种方式。渥堆方式、渥堆条件、毛茶原料嫩度及水分含量、渥堆过程中加水量以及人们对渥堆在制品品质的把控差异等决定了渥堆时间的长短，渥堆时间从十几小时至几十天不等。渥堆时间长短不同，样品的各种内含成分就会有所差异。例如，刘婷婷等[3]研究了传统四川黑茶在渥堆24 d过程中主要品质成分的变化，发现除咖啡碱含量变化不明显外，茶多酚、儿茶素、茶黄素、茶红素、茶褐素、游离氨基酸等均下降。邹瑶等[6]研究表明：一翻后，四川黑茶品质成分的转化已基本完成。而陈应娟等[4]发现游离氨基酸、茶多酚、儿茶素等的含量在加工过程中均减少，水浸出物、咖啡碱、茶黄素等的含量则增加。LI等[27]研究了下关沱茶渥堆56 d内相关内含成分的变化情况，发现茶多酚总量下降了54%，而咖啡碱含量上升了59%。茶氨酸和游离氨基酸含量分别降低了81.1%和92.85%。而LI等[28]发现水浸出物含量、茶多酚总量、总黄酮含量、游离氨基酸含量及可溶性糖含量在湖南黑毛茶渥堆12 h内均显著降低。本课题研究了四川黑茶干坯渥堆95 d内主要生化成分的变化情况，一些成分变化表现出了差异性。例如，水浸出含量在渥堆的前7 d显著增加，而后逐渐下降；咖啡碱含量在渥堆前13 d显著增加，第13～48天保持相对稳定，随后又逐渐增加至渥堆结束；儿茶素总量及其组分含量在渥堆前55 d迅速下降，随后至第61天有一个短暂的回升，最后又迅速下降至渥堆结束时的低值等。此外，还研究了四川黑茶渥堆过程中黄酮醇苷类物质含量的变化，发现除槲皮素-3-葡萄糖苷含量在渥堆结束后显著增加，黄酮醇苷总量及其他7个组分含量在渥堆结束后显著下降,且大多数黄酮醇苷在渥堆过程中呈现不断下降的趋势，黄酮苷类物质含量的普遍下降跟渥堆过程中在热和酶的作用下发生水解，并进一步氧化有关[26]。

四川黑茶渥堆过程中茶汤色泽变化非常明显，感官审评表明汤色由黄绿→绿黄→黄→橙黄→橙红→棕红→棕褐转变。研究表明，茶汤色泽与茶叶内多种内含成分存在极显著的相关性。以往部分研究及经验表明，不管是干茶还是茶汤色泽应由茶叶中呈色相关物质决定。例如杨娟等[8]研究表明茶褐素含量越高，茶汤的亮度越低，但茶汤更红。王璟等[15]研究表明黄茶的外观色度值与总叶绿素含量及茶红素含量有关。余书平等[13]研究表明红茶发酵叶色差值的变化能够较好地表征儿茶素组分、茶黄素组分、茶红素、茶褐素的变化特性。朱博等[7]研究表明杨梅素苷类与贮藏期间的绿茶茶汤色泽的关系最密切。但通过逐步回归与通径分析，考虑到各内含成分之间的相互关系与交互作用时发现，茶红素、茶褐素含量及黄酮醇苷总量等是直接影响四川黑茶茶汤L值的主要因素，茶黄素、茶褐素含量及黄酮醇苷总量是直接影响四川黑茶茶汤a值的主要因素，而茶多糖、茶褐素含量及儿茶素、黄酮醇苷总量是直接影响四川黑茶茶汤b值的主要因素。另外，一些物质还可以通过影响另一些物质的含量进而对茶汤色差值产生间接影响。本研究还建立了L、a、b值与主要内含成分之间的多元线性回归方程，初步探明了四川黑茶渥堆过程中茶汤色差值与主要内含成分之间的关系。