洋葱皮提取物对卡拉胶可食性膜的物化性质及生物活性的影响

由于塑料薄膜包装在环境中的积累造成污染，且其在高温下还会产生有害物质，并转移到食品中，从而带来人体健康隐患。因此，开发可再生的天然聚合物活性包装来替代塑料包装成为当下研究的热点。天然聚合物包装材料主要分为蛋白类、脂质类和多糖类[1]。其中多糖类因具有成膜性好、可生物降解、来源广泛等优点，已在食品、化工、医药等领域被广泛应用。卡拉胶(carrageenan，CA)作为一种主要来源于海洋藻类的天然多糖，因其来源丰富、可生物降解、成本相对较低而备受关注。CA常用于食品的胶凝、乳化、增稠以及稳定剂，并具有防止脂质氧化和稳定蛋白质的优点，由于其优良的凝胶性和高黏度特性，又具有良好的成膜性，可作为一种天然生物活性薄膜基材[2]。然而，CA单一膜在抗氧化、抑菌性方面存在不足，因此，从安全和市场的角度来看，为了延长食品的货架期，将天然抗氧化剂和可生物降解薄膜结合到一个单一的食品包装配方中成为了一个具有广阔前景的方法。

洋葱(Aillum cepa L.)中黄酮类化合物主要以黄酮醇、槲皮素和山奈酚为代表，它们以糖苷的形式主要存在于洋葱外层干皮中,洋葱皮乙醇提取物(ethanol extract of onion skins，EEOS)自由基清除率高达93%以上，接近槲皮素清除自由基的能力[3]。LEE等[4]证明洋葱皮提取物具有潜在的抗菌和抗氧化作用，其抗氧化作用是丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)的2倍。许多研究表明，多酚类物质可增强可食性薄膜的生物活性，CHI等[5]利用K型CA与羟丙基甲基纤维素共混，并添加了富含花青素的葡萄皮粉，制备出了能够表征猪肉新鲜度的智能薄膜。FARHAN等[6]以CA为基材，与发芽葫芦巴种子的水提物共混，制备出的活性薄膜可有效抑制贮藏期间鸡胸肉表面的微生物生长。另有报道表明，含有酚类化合物的天然抗氧化剂(包括绿茶、猕猴桃、大麦壳、迷迭香和牛至提取物)不仅可以减少肉中的脂质氧化，而且可以延长膜的功能寿命。然而，目前还未见有将EEOS与CA共混，制备复合膜的研究。

因此，本文以CA为基材，与紫色EEOS共混，制备EEOS-CA复合膜，分别从微观结构、物化性质、生物活性3个方面探讨不同浓度的紫色EEOS对CA活性薄膜的影响，为EEOS-CA复合膜的生产及应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫色洋葱皮、猪板油，齐齐哈尔市浏园市场；食品级CA，青岛德慧海洋生物技术有限公司；牛肉膏、胰蛋白胨(生化试剂)，北京奥博星生物技术有限公司；金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、大肠杆菌(ATCC 25922)，齐齐哈尔大学食品与生物工程学院；其他化学试剂(分析纯)，天津凯通化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

2L-ARE旋转蒸发器，上海皓庄仪器有限公司；GX-220高速不锈钢多功能粉碎机，浙江高鑫工贸有限公司；2.5 L freezePrysystem型真空冷冻干燥机，美国Labconco公司；S-4300型扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)，日本日立株式会社；Spectrum-100型傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectrum，FTIR)仪，美国PerkinElmer公司；Rint-2000型X-射线衍射(X-ray diffractometer，XRD)仪，日本理学株式会社；UPG-722可见分光光度计，北京优谱通用科技有限公司；TA.XT plus型质构仪，英国Stable Micro System公司；GZX-9146MBE型鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 EEOS的制备

取粉碎的紫色洋葱皮100 g，加入70%乙醇200 mL，在25 ℃下浸提2 h，将浸提液经6 000 r/min的离心处理，取上清液备用。离心后的沉渣再次经过浸提、离心处理，合并2次离心上清液。将合并后的提取液在旋转蒸发器中真空浓缩(50 ℃)，再将浓缩液冷冻干燥即为洋葱皮提取物，将洋葱皮提取物储存于4 ℃冰箱中备用。

1.3.2 EEOS-CA复合膜的制备

称取6 g CA粉于烧杯中，加入蒸馏水使其质量分数为2%，置于磁力搅拌器于80 ℃下搅拌30 min，使其完全溶解，并用热水补足蒸发掉的水分。向CA溶液中加入质量分数20%的甘油(在CA质量的基础上)，继续搅拌30 min。加入质量分数1%、3%、5%的EEOS(在CA质量的基础上)继续搅拌1 h。在60 ℃下水浴1 h以去除气泡。将直径为120 mm的聚乙烯环固定在铺有离型纸的玻璃板上，将35 g膜液浇铸在聚乙烯环内，固定15 min，置于鼓风干燥箱中在45 ℃下烘干12 h，揭膜，置于25 ℃、相对湿度为56.8%(NaBr饱和溶液)的干燥器中，平衡72 h后测定薄膜的各项指标。

1.3.3 FTIR测定

将平衡干燥后的薄膜置于衰减全反射(attenuated total reflectance，ATR)附件上，测试温度为25 ℃，波数4 000～650 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为32次。

1.3.4 XRD分析

样品的XRD分析，采用日本理学Rint-2000型XRD仪测量。采用Cu靶，石墨单色器，测试参数为：电压为45 kV、电流为20 mA，扫描范围为5～60°(2θ)，扫描速率为2°/min。

1.3.5 SEM

将薄膜样品剪裁成2 cm×6 cm的矩形，在液氮中破碎。扫描电压5.00 kV，电流64.0 μA。观察并拍照薄膜的表面和截面。

1.3.6 厚度的测定

参照GB/T 6672—2001《塑料薄膜和薄片 厚度测定 机械测量法》[7]的方法略作修改，用螺旋测微计(测量精度为0.001 mm)在薄膜上随机选取10个点测其厚度，计算平均值作为膜的厚度。在计算膜透明度、机械性能、水蒸气透过率(water vapor permeability，WVP)时，均采用厚度平均值。

1.3.7 WVP的测定

参照郭开红等[8]的拟杯子法，并略作修改。将10 g无水CaCl2置于鼓风干燥箱中，在110 ℃下烘干2 h，并放置在35 mm×90 mm的称量瓶中，将制备好的薄膜样品覆盖在称量瓶口，密封，放入底部装有蒸馏水的干燥器中。每隔24 h称取称量瓶的质量(精确到0.000 1 g)，连续测量10 d。每个样品测量3次，取平均值。薄膜的WVP计算如公式(1)所示:

(1)

式中：WVP，水分透过率，(g·mm)/(m2·d·kPa)；m，薄膜密封后称量瓶总质量，g；t，时间，d；A，薄膜透水面积，m2；X，薄膜厚度，mm；ΔP，薄膜两侧水蒸气压力差，1.583 kPa。

1.3.8 力学性能的测定

薄膜的力学性能采用质构仪进行测定。将薄膜裁剪成6 cm×2 cm的矩形，测试速度2 mm/s，初始夹距20 mm。测量薄膜样品的拉伸强度及断裂伸长率。每种样品测量3次，取平均值。CA薄膜的力学性能计算如公式(2)、公式(3)所示:

(2)

式中：Ts，拉伸强度，MPa；Fmax，膜断裂时最大负载，N；S，膜横截面积，mm2。

(3)

式中：EBA，断裂伸长率，%；l1，膜拉伸后长度，mm；l0，膜初始长度，20 mm。

1.3.9 体外抗氧化性能的测定

将10 mg薄膜样品与甲醇DPPH溶液(0.2 mmol/L，1.5 mL)混合。将混合液放入暗室反应，在室温下避光30 min，然后用紫外分光光度计在517 nm处测定混合液的吸光度，DPPH甲醇溶液作为对照[9]。每个样品测量3次，结果取平均值。自由基清除率计算如公式(4)所示：

(4)

式中：k，自由基清除能力，%；AC，对照组的吸光度；AS，样品的吸光度。

将ABTS溶解于20 mmol/L、pH 4.5的醋酸缓冲溶液中得到7 mmol/L的ABTS自由基贮液，与过硫酸钾溶液(混合体系中的终浓度为2.45 mmol/L)混合，在室温下避光反应12～16 h，使溶液达到稳定的氧化态。测定前用20 mmol/L、pH 4.5的醋酸缓冲溶液按照适当的体积比例(1∶75)稀释ABTS自由基贮液，使溶液的吸光值在734 nm下达到(0.7±0.02)，以此得到ABTS自由基工作液，该工作液每次测定前现配。将10 mg薄膜样品与ABTS自由基工作液混合，室温下避光6 min，用紫外分光光度计在734 nm处测定混合液的吸光度，以醋酸缓冲溶液代替提取物样品溶液作为空白对照[10]。每个样品测量3次，结果取平均值。自由基清除率按公式(4)计算。

1.3.10 油脂抗氧化性能的测定

薄膜的油脂抗氧化测定采用直接接触法。参照BAO等[11]方法，并略作修改。将5 g固体猪油包裹于薄膜上，将薄膜进行热封，置于60 ℃的鼓风干燥箱中加速氧化，每隔24 h定时取样，按GB 5009.227—2016[12]中的方法测定其过氧化值(peroxide value，POV)，连续测定7 d。每个样品测量3次，结果取平均值。

1.3.11 抑菌性的测定

参照PELISSARI等[13]方法，并略作修改，可依据抑菌圈直径大小判断薄膜的抑菌活性强弱。以大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为受试菌，将活化好的菌种用无菌生理盐水稀释10倍，作为初始菌液。用膜用取样器取直径为7 mm的薄膜样品若干，紫外线灭菌后，分别放入含有0.1 mL目标菌液的培养基中，将培养基倒置于(37±1)℃的恒温培养箱中培养24 h(整个过程在无菌环境中进行)。观察培养基的菌体生长情况，用游标卡尺测量抑菌圈直径。平行实验3次，取其平均值。

1.3.12 数据处理

实验结果用均值±标准差表示，通过软件SPSS 25系统中的Duncan’s进行差异显著性分析，采用Origin 8.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 FTIR分析

EEOS、CA膜和EEOS-CA复合膜的FTIR图谱如图1所示。EEOS以及CA膜的FTIR光谱具有多糖典型的特征吸收峰[14]。EEOS在3 230 cm-1处出现的宽峰为分子间O—H键的伸缩振动峰[15]；在2 926 cm-1处出现的肩峰为C—H的伸缩振动峰；在1 700～1 550 cm-1出现吸收峰，说明CO发生非对称伸缩振动和对称伸缩振动，而在1 600 cm-1处出现的吸收峰表明在EEOS的分子内分别含有CO官能团；1 161 cm-1处的峰来自酚类化合物C—O的伸缩振动；在1 000～700 cm-1出现了吸收峰，是α-和β-吡喃单糖的特征吸收峰，820 cm-1的吸收峰说明样品中含有α-吡喃单糖[14]。对于CA膜的FTIR光谱曲线，在3 301 cm-1处出现O—H键的伸缩振动峰；2 929 cm-1处出现C—H键的伸缩振动峰；1 649 cm-1处出现CO键的伸缩振动峰；1 414 cm-1处出现的峰来自O—H键的面内弯曲振动；1 019 cm-1处的吸收峰来自C—O键的伸缩振动；923和856 cm-1处的特征峰分别对应于CA结构中3,6-无水半乳糖和C—O—SO4在半乳糖-4-硫酸上的C—O键[16]。

图1 EEOS、CA膜及EEOS复合膜的FTIR光谱图
Fig.1 FTIR spectra of EEOS, CA single film and EEOS composite films

EEOS与CA共混之后，分子间O—H键与C—H键的伸缩振动峰强度变大，这是由于CA具有较高的分子质量，共混后O—H键和C—H键的数量增多，使之强度变大。添加了EEOS后，2 929和1 019 cm-1处的吸收峰分别移向2 933和1 025 cm-1处，这是由于化学键作用力增强，伸缩振动也随之增大，使得吸收峰向高波数移动。而随着EEOS添加量的增加，1 649 cm-1处CO键的伸缩振动峰发生微弱红移，这可能由于随着EEOS添加量的增多，供电子基团羟基的数量增加，从而诱导特征峰向低波数移动。

2.2 XRD分析

EEOS、CA膜以及EEOS-CA复合膜的XRD如图2所示。

图2 EEOS、CA膜及EEOS复合膜的XRD谱图
Fig.2 XRD spectra of EEOS, CA single film and EEOS composite films

EEOS在27.21°处出现衍射峰；CA单一膜在16.41°和22.51°出现衍射峰，当EEOS的添加量为1%时，16.41°附近的衍射峰消失，并且22.51°处的衍射峰强度明显降低。这是由于EEOS的加入打乱了CA骨架结构的有序性，致使薄膜的结晶度下降。随着EEOS添加量的增加，复合膜衍射峰的强度又有所回升，并且当EEOS添加量为5%时，在16.60°处又出现宽峰，这是由于EEOS中所富含的槲皮素为疏水性物质[17]，随着EEOS添加量的增加，使得CA中盐离子的反应难度增大，进而使得盐离子在薄膜中的密度增大，结晶度也随之增大。张赟彬等[18]将巴西甜橙精油添加到壳聚糖薄膜中也发现X射线衍射峰强度随着精油添加量的增加出现先减小后增大的现象。

2.3 表观图像及微观结构分析

CA膜及EEOS复合膜的表观图像如图3所示。CA单一膜无色透明，随着EEOS的添加，薄膜逐渐变为红黄色，且随着EEOS质量分数的增加，薄膜的颜色逐渐加深。

a-CA膜；b-1%EEOS-CA复合膜；c-3%EEOS-CA复合膜； d-5%EEOS-CA复合膜
图3 CA膜及EEOS复合膜的表观图像
Fig.3 Images of CA single film and EEOS composite films

利用SEM可进一步观察探究膜的微观结构以及与添加物之间的相互作用影响。图4为CA单一膜及EEOS-CA复合膜的表面、截面的SEM图。CA单一膜的表面较为平整，随着EEOS添加量的增加，复合膜表面逐渐呈现出隆起结构，这表明EEOS与CA之间发生了相互作用，致使膜表面变得凹凸不平，NOURI等[19]也观察到了类似的现象。从截面图可以看出，CA膜结构更为致密，截面较为平整光滑，当添加了EEOS后，截面逐渐变得粗糙，并且可以观察到EEOS少量不溶颗粒的存在。EEOS的添加量为5%时，截面变得更为粗糙，与表面结构所呈现的现象对应，表明EEOS与CA之间发生相互作用，进而影响了复合膜的空间结构。

A-CA膜表面；B-1%EEOS-CA复合膜表面；C-3%EEOS-CA复合膜表面；D-5%EEOS-CA复合膜表面； a-CA膜截面；b-1%EEOS-CA复合膜截面；c-3%EEOS-CA复合膜截面；d-5%EEOS-CA复合膜截面
图4 CA膜及EEOS复合膜的SEM图像
Fig.4 SEM images of CA single film and EEOS composite films

2.4 厚度和WVP

厚度是薄膜的物理性质中的一个重要指标，厚度的大小影响着薄膜的力学性能和WVP。影响薄膜厚度的因素有很多，例如薄膜的水分含量、所含固形物的多少等。EEOS添加量对薄膜厚度的影响如图5所示。在0%～5%时，EEOS的添加量和CA膜的厚度成线性关系，EEOS添加量越高，薄膜的厚度越大。所有薄膜在制作时，成膜时的膜液质量和烘干时间相同，而薄膜厚度并不相同，这表明EEOS添加量的不同，使得薄膜之间的分子排列结构也有所差异。这可能由于EEOS的加入，使得羟基、羰基等亲水基团增加，从而使薄膜的水分含量增加，薄膜的厚度也随之增加。并且，随着EEOS添加量的增加，复合膜中的固形物浓度也随之增加，使得薄膜的厚度增加[20]。

图5 CA膜及EEOS复合膜的厚度及WVP
Fig.5 Thickness and WVP of CA single film and EEOS composite films

WVP是衡量食品包装膜物理性能的重要指标，它反映了食品包装膜的渗透性与阻隔性。聚合物的极性是引起水蒸气渗透的重要原因，由于水蒸气分子可以和极性基团形成氢键，因此，含有极性基团较多的聚合物其吸水性较强，水分子透过薄膜的机会也随之增多，WVP增大[21]。薄膜的WVP值如图5所示，CA膜的WVP值为1.61 (g·mm)/(d·m2·kPa)，随着EEOS添加量的增加，复合膜的WVP值也随之增加，当添加量为5%时，复合膜的WVP值最大，达到2.33 (g·mm)/(d·m2·kPa)。这表明EEOS的加入影响了CA膜的物理性能，一方面，EEOS的加入使复合膜中—OH基团数量增多，极性增强，WVP也随之增大；另一方面，通过SEM图可以看出，随着EEOS添加量的增加，有少量的不溶性颗粒出现，这些不溶性颗粒使得复合膜的微观结构出现孔道，致使WVP增加[22]。

2.5 力学性能分析

薄膜的力学性能由拉伸强度和断裂伸长率表示。由图6可知，EEOS的添加量为0%～3%时，随着EEOS添加量的增加，薄膜的拉伸强度由最初的2.63增加到3.71 MPa，断裂伸长率由13.36%增加到37.95%，而当EEOS的添加量达到5%时，薄膜的拉伸强度降低至2.41 MPa，断裂伸长率降低至31.53%。这可能由于EEOS的添加，使得CA膜中氢键的数量增加，从而增加了卡拉骨架结构的内聚力，提高了薄膜内空间网状结构的稳定性，起到了交联的作用，使得薄膜的拉伸强度有所提高[23]。当EEOS达到一定浓度时，拉伸强度最佳，在此基础上继续添加EEOS，过量的EEOS在CA膜中的分散性变差，薄膜的空间网状结构受到破坏，致使其拉伸强度降低。由于EEOS中富含的黄酮醇类化合物，不仅能起到交联的作用，还对CA膜有一定的增塑作用，从而在一定范围内，薄膜的断裂伸长率有所提高，而当EEOS的添加量超过最大限度时，使得薄膜的断裂伸长率减弱。

图6 CA膜及EEOS复合膜的力学性能
Fig.6 Mechanical properties of CA single film and EEOS composite films

2.6 体外抗氧化性能分析

类黄酮化合物的抗氧化能力与羟基数量成正相关[24]，而洋葱皮中富含的槲皮素、槲皮苷等化合物中，羟基所释放的氢质子可清除氧自由基，从而起到抗氧化作用[25]。复合膜的体外抗氧化能力如图7所示。

图7 CA膜及EEOS复合膜的体外抗氧化性能
Fig.7 Antioxidant properties in vitro of CA single film and EEOS composite films

CA单一膜对DPPH和ABTS阳离子自由基清除能力较弱，而随着EEOS浓度的增加，复合膜对自由基的清除能力也显著提升。当EEOS质量分数为5%时，DPPH自由基清除率达到45.28%；而对ABTS阳离子自由基的清除能力也由9.81%增长到89.14%。

2.7 油脂抗氧化分析

油脂氧化的实质是具有不饱和键物质的氧化酸败过程，包括链引发、链传递和链终止3个阶段[26]，而洋葱皮中所含的类黄酮化合物可释放出氢质子，清除链引发阶段产生的自由基，达到抑制油脂氧化的目的[27]。油脂氧化过程的POV如图8所示，POV越大表明其氧化程度越大。未经包裹的猪油在7 d内氧化程度明显，由0.22增长到2.49 g/100 g。经薄膜包裹后，猪油在7 d内的POV明显低于未包裹的样品，表明复合膜对猪油的氧化起到抑制作用。然而，CA单一膜、1%及3% EEOS-CA复合膜对猪油氧化的抑制效果差异并不显著。而5% EEOS-CA复合膜对猪油氧化的抑制效果较差，在第7天，猪油的POV达到0.74 g/100 g。这与体外抗氧化能力的测定结果不同，并不是EEOS的浓度越大复合膜的抗氧化效果越好。这可能是由于随着EEOS添加量的增加，复合膜的微观结构和致密性受到了影响，从而使薄膜阻隔氧气透过的能力减弱。而经EEOS质量分数为3%的复合膜包裹的猪油在第7天时的POV较低，为0.122 g/100 g，表明在此质量分数下的复合膜对猪油氧化的抑制作用效果较好。

图8 CA膜及EEOS复合膜的油脂抗氧化性能
Fig.8 Antioxidant properties in axunge of CA single film and EEOS composite films

2.8 抑菌性分析

复合膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径如表1所示。CA单一膜对大肠杆菌的抑制效果并不明显，而对金黄色葡萄球菌的抑制效果更为明显，并且复合膜对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径更大，说明薄膜对革兰氏阳性菌的抑菌效果优于革兰氏阴性菌，这个结论与NOURI等[19]的报道一致。造成这种差异的原因主要是2种微生物的细胞壁结构不同，革兰氏阴性菌的细胞壁为多层结构，从内到外依次为肽聚糖层、脂蛋白层、磷脂层和脂多糖层，其细胞壁不易渗透亲脂性溶质，从而保护其内部结构不易受到外部侵害；而革兰氏阳性菌的细胞壁结构简单，仅由1层肽聚糖和磷壁酸组成，不含脂多糖，因此更易受到抑菌剂的抑制作用[28]。当添加EEOS后，对薄膜的抑菌效果有所改善，抑菌圈直径随着添加物浓度的增大而逐渐增大，EEOS含有的类黄酮化合物可以通过过氧化氢途径，降低细胞膜的流动性或对膜穿孔，进而破坏微生物的细胞膜，导致微生物细胞分泌紊乱，从而抑制微生物生长。

表1 CA膜及EEOS复合膜对微生物的抑菌圈直径
Table 1 Diameter of bacteriostasis circle of CA single film and EEOS composite films

注：不同字母表示差异显著(P<0.05)

3 结论

本文通过加入0%～5%质量分数的紫色EEOS与CA共混，制备复合膜。FTIR、XRD以及SEM的结果显示，EEOS的加入影响了复合膜的微观结构，薄膜的表面及截面随着EEOS浓度的增加而变得粗糙；EEOS的加入影响了薄膜的力学性能，其质量分数在3%时，薄膜具有较好的力学性能，而WVP值随着EEOS质量分数的增加而增加；薄膜的DPPH和ABTS阳离子自由基清除率随着EEOS质量分数的增加而显著上升，油脂抗氧化的实验结果显示，EEOS质量分数为5%的薄膜包裹的猪油在第7天时的POV较高，而质量分数为3%的薄膜效果最好，其包裹的猪油在第7天时POV最低；抑菌性试验结果显示，抑菌圈直径随着提取物质量分数的增加而增加，且薄膜对于革兰氏阳性菌的抑制作用优于革兰氏阴性菌。综上所述，当EEOS质量分数为3%时，薄膜的综合性能最佳，研究结果可为紫色EEOS-CA复合膜的生产和应用提供参考。