市售饮料对变异链球菌和白色念珠菌双菌致龋性的影响

龋齿是最常见的口腔细菌感染性疾病之一。其中，学龄前儿童患龋齿即低龄儿童龋(early childhood caries，ECC)的发生率位居儿童疾病的首位，严重危害儿童的健康[1]。龋齿的发生与微生物[2]、饮食[3]、宿主生活习惯等因素密切相关，其中微生物主导的牙菌斑生物膜的形成是龋齿的始动因子。生物膜是口腔微生物在牙齿表面定植并不断生长繁殖而形成的三维立体的微生态结构，能保护细菌免受药物的侵害，较浮游状态下显著提高了药物耐受性。变异链球菌具有很强的代谢蔗糖产酸并形成致龋性生物膜的能力，是公认的主要的致病菌。近年来临床研究又发现，白色念珠菌参与了龋齿的进程，在患ECC的儿童口腔菌斑生物膜中检出大量的白色念珠菌和变异链球菌[4]，二者相互作用会形成致龋性更强的生物膜[5-6]。

儿童对糖类的偏好等不健康的饮食习惯往往会加重龋齿的发生，大部分的饮料均添加了大量的蔗糖。饮食中的糖类物质可与龋病微生物形成的牙菌斑生物膜直接接触，为微生物提供碳源，使微生物定点产酸，导致牙齿脱矿，最后形成龋齿[7]。同时饮料中的酸也是重要的致龋因素[7]。不同类型饮料的酸和糖含量不同，故对龋齿具有不同程度的影响。罗彦妮[8]通过体外模型评定了4种乳饮料对变异链球菌生物膜的形成、产酸、牙齿脱矿等指标的影响，结果表明全脂牛奶致龋能力较低，椰奶具有较高的致龋能力，豆奶及核桃奶致龋能力处于中等水平；胡霞[9]通过采用Keyes经典评分方法评价了去离子水、可口可乐、鲜橙多和雪碧在大鼠模型中的致龋性，结果表明可口可乐、鲜橙多和雪碧对大鼠的牙齿均有酸蚀作用，会导致龋齿。而儿童偏好的饮料对于ECC中主要致龋菌白色念珠菌和变异链球菌双菌的致龋性影响尚未见报道。

牙菌斑生物膜的形成是龋病的始动因素，而饮料本身的酸会导致牙齿的酸蚀进而导致龋洞的产生。本研究以常见的市售饮料：碳酸饮料、果汁、乳制品和水为研究对象，探究它们的酸度、对双菌生物膜形成量的影响、对羟基磷灰石脱矿程度等指标，以评价不同饮料对双菌致龋性的影响，为儿童饮料的选择提供参考，也为替代性饮料配方的改良提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 菌株、试剂与培养基

变异链球菌(Streptococcus mutans)ATCC 25175、白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 18804，中国普通微生物菌种保藏管理中心，现保藏于江南大学食品生物技术中心；哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)BB170，保藏于江南大学食品生物技术中心；紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)CV026，由江南大学食品安全与质量控制中心姚卫蓉老师惠赠。

结晶紫、甲醇、无水乙醇、羟基磷灰石，国药沪试；人工唾液，北京百奥莱博科技有限公司；康宁96孔细胞培养板，南通市海之星实验器材有限公司；2216E培养基，青岛海博；C6-HSL，Sigma。

可口可乐、雪碧、芬达，可口可乐中国公司；冰糖雪梨、水晶葡萄、橙汁、纯净水，康师傅控股有限公司；纯牛奶、酸奶，光明乳业股份有限公司；上述饮料均购自江南大学世纪华联超市。

TSB培养基(g/L)：胰蛋白胨17.0，酵母粉6.0，NaCl 5.0，大豆蛋白胨3.0，葡萄糖2.5，K2HPO4 2.5，pH 7.0～7.4；YPD培养基(g/L)：蛋白胨20，葡萄糖20，酵母粉10；LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10；以上培养基均在115 ℃高压灭菌 20 min。AB培养基(mol/L)：0.3 NaCl，0.05 Mg2SO4、2%(质量分数)酸水解酪蛋白，115 ℃高压灭菌 20 min后加入10 mL 1 mol/L的无菌磷酸钾缓冲液，10 mL 0.1 mol/L的无菌精氨酸溶液和20 mL 50%(体积分数)无菌甘油。

1.2 仪器与设备

Multiscan Go全波长酶标仪，赛默飞世尔科技有限公司；台式冷冻高速离心机，德国Eppendorf公司；NexION 350D电感耦合等离子体质谱仪，美国Perkin Elmer公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的培养

取出-80 ℃保藏的变异链球菌ATCC 25175，以2%的接种量接种于5 mL TSB液体培养基中，37 ℃静置培养18 h。以相同的接种量将白色念珠菌ATCC 18804接种于YPD液体培养基中，37 ℃摇床培养18 h。紫色杆菌CV026接种于含10 μg/mL卡钠霉素的LB培养基中，28 ℃摇床培养过夜。哈维氏弧菌BB170接种于2216E液体培养基，28 ℃摇床培养过夜。所有菌株均活化3代后再用于实验。

1.3.2 不同饮料缓冲能力及pH的测定

通过pH滴定法检测饮料的缓冲能力，并将pH值改变1个单位所需的1 mol/L HCl的物质的量记录为缓冲容量。测定培养前饮料的初始pH和饮料与致病菌混合体系培养后的pH[8]。

1.3.3 不同饮料对双菌生物膜形成的影响

将变异链球菌和白色念珠菌以2%的接种量分别接种至新鲜质量分数1%蔗糖的TSB和YPD培养基，于96孔板中加入致病菌菌悬液各75 μL，再加入50 μL待测饮料，对照以无菌纯净水代替。培养24 h后，去除上清液，用PBS小心清洗生物膜2遍，室温静置晾干生物膜后向每孔加入100 μL甲醇以固定生物膜，10 min后除去甲醇，自然晾干，加入100 μL 0.1%结晶紫溶液，将生物膜染色30 min，染色结束后用PBS清洗2遍，每孔以体积分数33%的冰醋酸溶解，用酶标仪OD600 nm读取吸光度值[10]。

1.3.4 不同饮料对双菌群体感应系统的影响

参考丁婷等[11]的方法，将紫色杆菌CV026涂布于LB琼脂培养基表面，使用滤纸片法，加入10 μL双菌共培养的上清液，室温孵育1 h，之后在28 ℃下过夜培养。以C6-HSL作为阳性对照，甲醇作为阴性对照。在孔周围观察紫色光圈，有紫色圈说明群体感应过程中会产生酰基高丝氨酸内酯(acylated homoserine lactones，AHL)。

参考ZHU等[12]的方法，采用哈维氏弧菌BB170生物发光法检测变异链球菌和白色念珠菌种间自诱导分子AI-2的活性。在24孔板中加入变异链球菌和白色念珠菌菌悬液各375 μL，再加入250 μL待测饮料，对照以无菌水代替饮料，培养24 h后，收集、过滤获得无菌上清液，备用。活化后的哈维氏弧菌BB170 接种于AB培养基，30 ℃、180 r/min 培养12 h，调节菌液OD595 nm为0.8左右，再用无菌新鲜AB培养基按 1∶2 000稀释该菌液，混匀备用。按1∶50比例将上述收集的上清液与哈维氏弧菌BB170稀释菌悬液混合。30 ℃、100 r/min 摇瓶培养5 h，避光条件下吸取200 μL于黑色不透明酶标板中，以多功能酶标仪于OD500 nm检测哈维氏弧菌BB170化学发光情况，以无菌水作为阴性对照。

1.3.5 不同饮料对唾液包被羟基磷灰石钙流失率的影响

参考秦苏佳等[13]的方法，稍有改动。按照1 mg羟基磷灰石:200 μL人工唾液的比例充分混匀，取200 μL悬浮液包被96孔板，37 ℃孵育过夜。然后2 000 r/min离心10 min。弃上清液，风干后的96孔板即为包被好的羟基磷灰石模型。

将唾液包被的羟基磷灰石放入96孔板中，将变异链球菌和白色念珠菌以2%的接种量分别接种至新鲜含1%蔗糖的TSB和YPD培养基，随后加入该致病菌菌悬液各75 μL，再加入50 μL待测饮料，对照以无菌纯净水代替饮料，培养24 h后取培养液8 000 r/min离心5 min，上清样品经硝酸消化后在电感耦合等离子体质谱仪下测定钙离子浓度[13]。

1.3.6 数据分析

所有实验均重复3次以上，数据分析使用Graphpad Prism 8.4.3，SPSS，R studio。使用One-way anova进行方差分析，P<0.05表示具有显著性差异，使用R包pheatmap等进行聚类热图分析。

2 结果与分析

2.1 不同饮料的酸度和缓冲能力

本研究所选的饮料含糖量接近，但酸度相差较大，而饮料本身的酸度是重要的致龋因素，可以导致牙齿的酸蚀。pH值和缓冲容量是反映饮料的酸蚀能力的重要指标[14]。从图1-a可知，果汁和碳酸饮料均具有较低的pH(<4)，而牛奶和矿泉水则呈现中性，pH为7左右，而酸奶由于本身黏度较高，无法直接测定，将其稀释至原浓度1/10，其pH在4左右。饮料的缓冲能力是通过测量其缓冲容量来评价的，通常饮料中所含的酸式盐使其具有一定的缓冲能力，通过测量缓冲容量即pH值改变1个单位所需的1 mol/L HCl的物质的量可以反映饮料的缓冲能力。

a-饮料的初始pH；b-饮料的缓冲容量
图1 饮料的酸蚀能力
Fig.1 Etching ability of beverages

从图1-b可知，可乐的缓冲容量最强，可能具有最强的酸蚀能力，会增加龋齿的风险。牛奶也具有较强的缓冲能力，牛奶蛋白质含量丰富，且含有大量的钙等无机盐离子，使其具有良好的缓冲能力[14]。

2.2 不同饮料对双菌生物膜形成的影响

牙菌斑生物膜的形成是龋病的始动因素，变异链球菌和白色念珠菌双菌生物膜的形成量是评价饮料致龋性的重要指标。由图2可知，除酸奶外其他饮料的加入都使双菌形成很强的生物膜，其OD600 nm>3。其中纯牛奶使双菌生物膜形成量最大，其OD600 nm达到3.47。牛奶中含有丰富的蛋白质，可以作为微生物优良的氮源，且其pH为中性，适宜微生物旺盛生长，因而形成了较强的生物膜。牛奶富含营养，是儿童家长倾向于购买的饮料，但其致龋能力仍需要结合脱矿情况和体内实验以更好的评价。而果汁和碳酸饮料pH均为酸性，且双菌生物膜形成量高，致龋性较强。相比之下，酸奶具有显著的抑制生物膜形成的效果，这可能由于酸奶发酵过程中加入的乳杆菌具有调节口腔微生态的作用，且不同于其他饮料当中的柠檬酸，酸奶发酵过程产生的乳酸对致龋菌的生长可能起到了一定的抑制作用[15]，故形成的生物膜量最低。

图2 饮料对双菌生物膜形成的影响
Fig.2 Effect of beverages on the formation of double bacteria biofilm

2.3 不同饮料对双菌群体感应系统的影响

牙菌斑生物膜的形成与群体感应信号分子的调控密切相关[16]，群体感应是细菌根据细胞密度变化来调控基因表达的一种生理行为，其中存在于革兰氏阴性菌和真菌中的基于AHL的信号分子[17]和广泛存在于各微生物种间交流的AI-2的信号分子在微生物相互交流中起着重要作用[18]。群体感应系统参与了大量基因表达的调控，包括发光效应、生物膜形成、运动能力等多种表型[19]，通过群体感应系统可以从另一个角度反映生物膜的形成。由图3-a可知，双菌的上清液中不存在AHL类物质，没有使紫色杆菌呈现紫色光圈。因此，后续实验着重讨论基于AI-2的群体感应。

口腔复杂环境中通常为多菌共生，不同菌种间通过信号分子传递信息，相互调节[16]，AI-2作为一种种间信号分子在跨物种间的信息交流中具有重要的意义。哈维氏弧菌发光现象受到群体感应系统的调控，我们选用了仅能响应AI-2调控的哈维氏弧菌突变株BB170探究不同饮料的群体感应现象，测定了不同饮料对双菌群体感应信号分子AI-2活性的影响。结果表明可乐、纯牛奶、酸奶显著促进了哈维氏弧菌的发光，即促进了双菌间的AI-2分子的产生，而冰糖雪梨和橙汁则在一定程度上抑制了双菌间的AI-2分子的产生。与图2生物膜形成结果相对应，大部分饮料生物膜的形成与群体感应信号分子的产生呈正相关，有趣的是，酸奶抑制了双菌生物膜形成，但并未抑制双菌间的AI-2分子的产生，这表明酸奶对生物膜的抑制并非通过群体感应途径，可能通过其他调控机制进行。

a-双菌的AHL检测；b-饮料对双菌产AI-2的影响
图3 群体感应检测
Fig.3 Quorum sensing detection

2.4 不同饮料对双菌产酸的影响

不同饮料使双菌在培养过程中pH变化的程度不同。由图4可知，加入饮料共培养后双菌上清液有接近的pH值，但由于不同的饮料中含有酸的类型和浓度不同，对口腔致龋菌造成的影响不同，决定了饮料的致龋性。果汁中主要含柠檬酸和抗坏血酸，碳酸饮料主要含碳酸和柠檬酸，而酸奶主要含乳酸菌发酵产生的乳酸。DELECRODE等[20]将志愿者口腔中获得的牙本质标本暴露在柠檬酸和乳酸中，通过蛋白质组学研究共鉴定出223个不同的蛋白，其中柠檬酸显著减少了耐酸蛋白如黏蛋白的含量，乳酸则没有，而耐酸蛋白与牙齿稳态保护作用有关，因此柠檬酸可能比乳酸具有更强的致龋性。碳酸饮料中的可乐本身具有最低的pH，在培养过后使双菌产酸量更大，这表明，可乐具有极强的酸蚀能力且可以促进菌产酸，具有较强的致龋性。

图4 双菌在添加不同饮料培养后的pH
Fig.4 pH value of double-species culture after adding different drinks

2.5 不同饮料对羟基磷灰石钙流失率的影响

龋齿的发生是牙齿脱矿的过程，脱矿过程会伴随着钙离子的流失。饮料的酸蚀性可能也会引起牙齿的脱矿，牙菌斑中的致龋菌本身会利用蔗糖产酸，其存在也将增加牙本质的脱矿[21]。为探究饮料对致龋菌脱钙的影响，用羟基磷灰石模拟牙齿，测定饮料与双菌共培养后的脱钙量。由图5可知，可乐的脱钙率显著高于其他组，这也与图1-b中反映饮料酸蚀能力的缓冲容量这一指标相吻合，酸蚀能力强则脱钙较严重。

图5 不同饮料对唾液包被羟基磷灰石钙流失率的影响
Fig.5 Effect of different soft drinks on the loss rate of saliva-coated calcium hydroxyapatite

2.6 饮料的特性与致龋性聚类热图分析

龋齿的发生是多种因素共同导致的结果，为全面分析饮料对龋齿的影响，对上述测定的指标进行了聚类热图分析(图6)。在图6中，颜色越接近红色，表明饮料对该特性的影响越强，颜色越接近蓝色，表明饮料对该特性的影响越弱。从总体上看，碳酸饮料中的可乐和芬达具有较强的酸蚀能力和钙流失率，引起龋齿的风险更大；果汁饮料仅次于碳酸饮料，具有较强的促进双菌生物膜形成的能力，本身也具有较低的pH，酸蚀能力较强；而纯牛奶和水本身的pH接近中性，在与双菌共培养过程中pH变化最为显著，在体外牛奶也会促进生物膜形成，这可能由于其丰富的营养有利于微生物生长繁殖；而酸奶本身的pH较低，但却可以显著抑制生物膜的形成，钙流失率也较低，不会促进龋齿的发生。

图6 饮料的特性与致龋性聚类热图分析
Fig.6 Cluster analysis of beverage characteristics and cariogenicity

3 结论

本研究通过测定市售饮料酸度对变异链球菌和白色念珠菌双菌生物膜形成量的影响、对双菌群体感应系统的影响，以及对羟基磷灰石脱矿程度的影响等指标来评价饮料对双菌的致龋性影响，初步探究了不同饮料的致龋性，对于同类型的饮料，虽pH接近但对双菌致龋性影响也有差异，其中可乐酸蚀能力强且造成牙齿钙流失率高。本研究为将来继续深入分析饮料的致龋性提供了一定的理论指导，也为儿童饮料的选择提供了参考。