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摇床T25细胞培养瓶流体力学与传质特性研究

作者：刘宏斐李雪良钱钧弢刘金堵国成陈坚来源：《化工学报》日期：2022-05-17人气：7909

引言

动物细胞培养是生物技术的一个重要分支，是现代生物医药的支柱。现有的治疗性生物制品超过50%在动物细胞中产生。2018年，基于动物细胞培养的诊疗产品产值约为2372亿美元，预计2024年增长至3890亿美元[1]。随着细胞培养工艺的日渐成熟，近年来又有新的应用领域被开发出来，如细胞培养肉技术[2]。在这种背景下，越来越多的研究人员开始关注动物细胞培养相关研究。

实验室规模的动物细胞培养常在孔板、方瓶和转瓶中进行[3]。其中孔板和方瓶主要用于静置培养，转瓶主要用于悬浮培养。相对于静置培养，悬浮培养可以达到更高的细胞密度，尤其是对于贴壁依赖型细胞，如常用的模式细胞HEK293[4]，某些CHO细胞系，以及牛[5]或者猪肌肉干细胞[6]等。这些细胞在孔板或方瓶中单层贴壁培养仅能达到104~105 cells/cm2，而悬浮培养则可以达到106~107 cells/ml或更高。在细胞培养放大过程中，方瓶还常常作为中间步骤用于转瓶或小型搅拌釜反应器之前[4]。Zhang等[7]通过分析得出，实验室常用的Thermo Fisher Scientific T25培养瓶的传质系数比250 ml转瓶高10倍左右，理论上可以支持更高的细胞浓度。如果可以在方瓶中进行悬浮培养，尤其是加有微载体的悬浮培养，进而达到更高的密度，对简化细胞培养工艺、减少放大步骤将有很大的帮助。此外，得益于方瓶的微小体积（T25方瓶最大装液量不超过10 ml），还可以实现高通量筛选，避免静置培养时由于混合、传质、剪切等条件与大型反应器不同，筛选到不适合大规模生产的细胞系或者培养基[8]。

Fujii等[9]研究了使用超声波使细胞在T25培养瓶中悬浮的技术，发现在超声波的作用下悬浮的CHO细胞增殖1000倍的时间比静置培养缩短了14%。然而这种做法需要特殊的超声波发生器，较难推广。事实上，只要将方瓶置于翘板摇床（或称“摆床”）之上，就有可能实现悬浮培养，其机理类似于思拓凡(Cytiva，原GE Healthcare)的波浪式（WAVE®）反应器。此类反应器出现在20世纪90年代，是最早的一次性生物反应器，如今已广泛应用于从实验室到中试规模的细胞培养[10-12]。Zhan等[13]通过计算流体力学(CFD)模拟研究了WAVE反应器内的流体力学特性，并发现了特定摆动频率下由于共振现象使混合和传质变差的现象。然而，由于方瓶特征尺寸较小，湍流程度较低，其操作条件与常规的台式波浪反应器之间不能简单换算，因此有必要针对T25培养瓶进行进一步研究。

本文将传统上一般用于静置培养的T25方形培养瓶置于翘板摇床上，对其传质及混合特性进行了系统性研究，并借助CFD模型对不同操作条件下的能量耗散和剪切情况进行了分析。报道了不同振荡频率下T25方瓶的传质系数、混合时间等基础数据，为使用该装置进行高密度细胞悬浮培养提供数据支持和理论参考。这将有利于推动基于T25方瓶的一次性微型反应器开发，实现高通量筛选，促进生物医药产业的发展。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

T25细胞培养瓶，购自Thermo Fisher Scientific公司，材质为聚苯乙烯，底面积为25 cm2，工作体积7 ml。实验中所需的磷酸二氢钾（99%）、氯化钠（99.8%）、二水合磷酸二氢钠（99%）和十二水合磷酸氢二钠（99%），购自国药集团化学试剂有限公司。溴百里香酚蓝（生物技术级），购自上海麦克林生化科技有限公司。氮气，购自无锡市鑫锡仪科技有限公司。实验用水为超纯水。称取0.072 g磷酸二氢钾，0.531 g十二水合磷酸氢二钠和4.5 g氯化钠于烧杯中，加少量水溶解，转移到容量瓶中并定容至500 ml，配制得到PBS溶液。取5.3 ml的0.2 mol/L的二水合磷酸二氢钠溶液与94.7 ml的0.2 mol/L的十二水合磷酸氢二钠溶液混匀，取10 ml混合液加0.1 g溴百里香酚蓝，配制得到示踪剂溶液。