黄金茶红茶加工过程中香气成分及其相关酶活性的动态变化

除滋味、色泽(茶汤与干茶)之外，香气也是评估红茶风味品质、产品等级和品质优劣的一个重要指标，其实质是不同种类及比例的挥发性有机化合物综合作用的结果[1-2]。这些挥发性化合物一方面来源于茶树自身的酶促反应，另一方面则源自茶叶加工过程中发生的一系列化学反应[3]。

红茶属于全发酵茶，萎凋及发酵工序使其香气的形成与转变较其他茶类更为充分，因此，形成的香气种类繁多且含量丰富[4]。存在茶鲜叶中的芳香物质约80种，且以具青草气味的青叶醇为主，而迄今为止，已检测鉴定出的红茶香气物质达400余种[5]。可见在红茶众多的香气组合中，仅有极少数来源于茶鲜叶中的游离态香气成分。绝大部分是由存在于鲜叶中的香气前体物质在多种酶的催化下，在茶叶加工过程中进行一系列的酶促氧化，发生聚合或缩合反应，产生种类丰富的芳香物质，最终形成红茶优良的香气品质[6]。

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，β-GC)、醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)、脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX)对红茶香气的形成起着重要作用。β-GC作为一种水解酶，可将糖苷类物质水解成游离态香气，而LOX则将亚麻酸、亚油酸等脂肪酸类物质氧化形成β-氢氧化物，再经脂氢过氧化物裂解酶(hydroperoxidelyase，HPL)催化形成顺-3-己烯醛，最终经ADH的催化还原作用形成顺-3-己烯醇(青叶醇)，再经氧化降解形成小分子的醛、酮、酸等化合物，成为构成红茶香气的物质之一[7-8]。

保靖黄金茶发源于湖南省湘西自治州保靖县葫芦镇黄金村，内含物质丰富，制成的红茶茶黄素、氨基酸、糖类物质含量高，近年来，成为湖南省主要种植及红茶加工的茶树品种。但由于饮茶和消费的影响，黄金茶红茶兴起较晚，加工工艺有待优化，产品品质参差不齐[9]。因此，本研究以保靖黄金茶加工的红茶为研究对象，探究在红茶不同加工过程中β-GC、ADH、LOX的活性及各种香气组分含量的变化，以期进一步丰富保靖黄金茶红茶的品质理论，为其加工过程中的品质调控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品制作

鲜叶原料均采自湖南湘西妙古金茶叶公司茶园，品种为保靖黄金茶，原料等级为一芽二叶，采摘时间为2020年8月上旬。

样品加工流程：

鲜叶萎凋(室内萎凋，鲜叶薄摊2～3 cm，平均气温20 ℃，至鲜叶含水量为62%～63%止揉捻(不加压5 min、轻压10 min、重压10 min、轻压5 min、重压10 min、轻压5 min)发酵(发酵室，温度28 ℃、相对湿度90%以上，发酵4 h)干燥(链板式烘干机、毛火温度120 ℃、足火温度100 ℃至足干)

取样：于鲜叶、萎凋、揉捻、发酵等4个加工过程取样，取样后将样品迅速用液氮固定、置于-80 ℃贮存待进一步分析。

1.2 仪器与设备

5424R型Eppendorf台式高速冷冻离心机，艾本德生命科技有限公司；Biotek Epoch全波长酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；移液枪、96孔板、AE240型Mettler电子分析天平，瑞士Mettler仪器有限公司；DK-S24型恒温水浴锅，上海精宏有限公司；全自动样品快速研磨仪，上海净信实业发展有限公司；QP2010型GC-MS，日本岛津公司；手动SPME进样手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，美国Supelco公司；ADH试剂盒、LOX试剂盒、β-GC试剂盒，苏州科铭生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 β-GC、ADH、LOX活性测定

样品前处理：用离心管称取0.1 g试样置于快速研磨仪进行研磨。

酶活性测定：LOX、ADH、β-GC 3种酶活性的测定均按照试剂盒步骤操作。

1.3.2 香气检测

采用固相微萃取-气质联用技术(solid-phase microextraction/GC-MS，SPME/GC-MS)进行分析。

前处理：固相微萃取头经240 ℃老化45 min后备用。称取2 g粉碎后的茶样，装入15 mL萃取瓶中,以四氟乙烯封口，于80 ℃恒温水浴中平衡10 min，吸附50 min后，在250 ℃下解析5 min。

GC条件：石英色谱柱(0.25 μm×60.0 m×0.25 mm)，柱温箱温度：60.0 ℃，不分流进样，进样量1 μL，进样温度250 ℃，样品流速1.96 mL/min，升温程序60 ℃保留5 min，3 ℃/min升至140 ℃保留5 min，10 ℃/min升至230 ℃保留5 min，10 ℃/min升至260 ℃保留5 min，载气为高纯度He。

MS条件：温度200 ℃，色谱接口温度220 ℃，电子轰击离子源，质核比范围：45～500 m/z。

利用NIST标准谱库对GC-MS分析得到的色谱峰信息进行串联检索和人工解析，根据相对保留时间进行物质鉴定，按照面积归一法计算所检测到的各组分的相对含量。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2019、SPSS 26软件进行数据归类、分析和计算，Origin 2019、GraphPad Prism 8.0进行作图。

2 结果与分析

2.1 加工过程中β-GC、ADH、LOX活性变化

如图1所示，β-GC在萎凋期间活性随萎凋时间的延长而增加，萎凋结束时增加至88.73 nmol/(min·g)，达到鲜叶的1.39倍；经揉捻工序后，酶活性开始呈下降趋势，相比萎凋工序降幅达17.8%；发酵时，β-GC活性降幅高于揉捻工序达65.8%。萎凋期间ADH活性逐步增强，特别是在萎凋结束，达到鲜叶ADH酶活性的3.25倍，增幅最大；经揉捻后，酶活性降至萎凋叶的40%左右；发酵过程中，酶活性呈持续下降趋势。随着萎凋时间的增加，LOX酶活性整体上逐渐增强，萎凋结束时达鲜叶酶活性的3.56倍，是整个加工过程中酶活性的最高点；揉捻结束后活性迅速降低，为萎凋叶的41%；发酵过程中酶活性持续而缓慢的下降。这表明，在红茶加工过程中，β-GC、ADH、LOX 3种酶的酶活性变化趋势呈现相似的变化规律，酶活性从鲜叶到萎凋结束持续增加直至揉捻初期最高，随后在揉捻后期、发酵工序中急剧下降。这可能是由于萎凋期间鲜叶水分散失，酶及其作用底物相对含量升高，pH下降，酶活性增强[10]；酚类及其氧化中间产物是蛋白质的天然沉淀剂，揉捻阶段，叶细胞破损，使得酚类物质大量析出，降低了酶的活性。发酵过程中，底物和酶开始接触并发生酶促反应，酶底物含量减少，从而使酶活性下降[11]。

β-GC能促进茶叶中糖苷类香气前体物质的水解以及形成萜烯醇类和芳香醇类的化合物，释放大量的香叶醇、芳樟醇等游离态挥发性物质，从而形成红茶的特征香气[12]。刘莉华等[13]的研究结果表明，在加工过程中，红碎茶的β-GC活性在萎凋结束时达到最高，之后持续下降；而工夫红茶则是从萎凋结束至揉捻初期酶活性最高，且低温有利于酶活性的保持。在红茶发酵过程中，β-GC的活性明显受温度的影响，温度的增幅与其活性下降速率呈正相关；与高温条件(25 ℃)相比，处于较低温度(20 ℃)下的β-GC活性下降速率明显减缓。因此，适当的低温发酵可保持β-GC活性，有利于红茶香气的形成[14]。项丽慧等[15]进行了红茶的黄光萎凋试验，结果发现，在萎凋期间补充黄光，可在前期促进萎凋叶香气的相关酶基因上调表达从而使β-GC活性在萎凋后期得到提高，最终使得红茶呈甜花香。在红茶制造过程中，LOX与ADH协同作用于催化亚麻酸和亚油酸氧化形成正己醛、己烯醇及己烯醛等化合物，参与红茶香气构成。LOX是一种能氧化不饱和脂肪酸生成不饱和脂肪酸过氧化物的生物催化剂，其活性的高低是导致不同地区茶鲜叶香气成分差异的原因之一[16]。有研究指出[7]，ADH的活性受基因Cs ADH的调控，在茶叶萎凋过程中，叶片和茎的损伤胁迫诱导使Cs ADH基因表达，促进青叶醇等C6芳香物质的积累。

a-β-GC活性；b-ADH活性；c-LOX活性
图1 红茶加工过程中纤β-GC、ADH、LOX的酶活性变化
Fig.1 Changes of β-GC, ADH and LOX enzyme activities during black tea processing

2.2 加工过程中的香气类别的变化

本试验共检测到263种香气组分，包括53种醇、53种烯烃、70种烷烃、36种酯、14种酮、17种醛和20种其他类化合物，其中，鲜叶、萎凋、揉捻、发酵等工序中分别检测出138、136、137、122种香气成分。如图2所示，整个加工过程中香气成分以醇类为主，揉捻叶样品中醇类挥发物所占比例最高，其中芳樟醇、香叶醇、四氢-α,α,5-三甲基-5-乙烯基呋喃-2-甲醇、反式-橙花叔醇、苯乙醇相对含量较高；烯烃类在鲜叶中所占比例最高，然后逐渐降低，经揉捻工序后含量略有上升，发酵后又有所下降。值得注意的是，具有花香气味的α-法尼烯是所有样品中含量最丰富的烯烃，其含量显著高于其他样品。酯类所占比例仅次于醇类，在鲜叶中含量最高。令人惊讶的是，在加工过程中，酯类的比例变化与醇的相似，在加工过程中含量变化趋势为从降低到升高再降低；醛类在萎凋叶中比例最低，在发酵叶中比例最高；酮类物质的含量从鲜叶开始至整个加工过程中逐渐升高，并在整个生产过程中保持稳定。此外，烷烃类化合物在鲜叶和萎凋叶中比例较高，揉捻和发酵时含量下降且趋于稳定，从萎凋到揉捻，烷烃类化合物含量降幅约为30%。

从鲜叶状态到发酵结束，香气组成和相对含量均有明显差异，最显著的变化趋势是烷烃类成分、烯烃类和酮类化合物成分相对含量的急剧降低以及香气组分中醛类、酯类等成分的持续增加。导致这种变化的直接原因可能是加工过程中，糖苷水解、类胡萝卜素、氨基酸或脂质降解等释放的挥发性化合物使不同类别的香气成分发生降解或生成[4]。

图2 红茶加工过程中的香气类别的变化
Fig.2 Changes in aroma categories during black tea processing

2.3 加工过程中主要香气组分及相对含量变化分析

通过GC-MS技术分离鉴定到主要的47种香气成分，如表1所示，其中醇类12种、酮类7种、醛类8种、酯类7种、烷烃类3种、烯烃类化合物7种和其他化合物3种。这47种香气组分中有23种成分具有相同变化趋势，其中11种在加工过程中相对含量逐渐升高，分别为苯甲醇、异香叶醇、α-衣兰油烯、苯甲醛、反式-2-壬烯醛、反-2-辛烯醛、β-环柠檬醛、甲基庚烯酮、3,5-辛二烯-2-酮、α-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯。12种在加工过程中相对含量降低，分别为6-异辛醇、芳樟醇、α-松油醇、2-甲基十四烷、正十三烷、正十四烷、α-法尼烯、(3E,7E)-4,8,12-三甲基三苯甲基-1,3,7,11-四烯、罗勒烯、反式-2-癸烯醛、β-紫罗兰酮、茉莉酸甲酯，其余24种香气组分均呈不规则的变化趋势。

2.3.1 醇类的变化分析

醇类化合物主要分为脂肪族醇、芳香族醇和萜烯醇3类，而具有花果香的萜烯醇是红茶香气中的重要成分之一[17]。在本研究中，相对含量较高的醇类有苯乙醇(3.83%～5.08%)、香叶醇(4.13%～9.13%)、反式-橙花叔醇(1.99%～5.64%)、芳樟醇(24.52%～34.38%)等，其中，具有铃兰花香的芳樟醇是红茶中含量较高的香气组分之一，对红茶香型形成有重要作用。鲜叶中，芳樟醇的相对含量为34.15%，在揉捻和发酵时有较大程度的降低，这与杨娟等[18]研究结果不同，这可能是加工工艺和茶树品种不同所致。散发玫瑰香的香叶醇是祁门红茶和福建红茶的特征性香气成分，在鲜叶中相对含量为5.79%，之后呈波动性变化。苯乙醇具有玫瑰香，揉捻叶中含量最高(5.08%)，发酵后降至(4.86%)，但其阈值较高(750～1 100 μg/L)，对红茶香气形成的影响需进一步研究[19]。竹尾忠一等[20]认为，中国红茶的香型分为三类：第1种是芳樟醇及其氧化物主导型，第2种是香叶醇和芳樟醇综合的中间型，第3种是香叶醇主导型。可以发现，在黄金茶红茶的4个加工阶段中，芳樟醇的相对含量均显著高于香叶醇，初步推测其香气特征可能属于芳樟醇及其氧化物主导型。

2.3.2 醛类、酯类的变化分析

红茶中含有大量挥发性物质，包括来源于饱和及不饱和脂肪酸的醛和酯[21]。酯类分为萜烯酯类和芳香族酯类，通常具有强烈而令人愉快的花香；醛类与红茶香型的形成密切相关，主要包括脂肪族醛、芳香族醛和萜烯醛[5]。如表1所示，酯类在加工过程中总体呈波动性变化趋势，其相对含量仅次于醇类；醛类物质在鲜叶中含量较低，伴随着萎凋、揉捻、发酵的进行，其相对含量逐步增高，此变化趋势可能与醇类物质的转化有关[5]。由表1可知，在红茶加工过程中，相对含量较高的酯类有水杨酸甲酯(6.73%～11.92%)、(4E)-4E-己酸己酯(0.87%～1.49%)、二氢猕猴桃内酯(0%～0.36%)等，相对含量较高的醛类有苯甲醛(0.69%～1.95%)、反-2-辛烯醛(0.19%～0.75%)、庚二烯醛(0.21%～1.03%)、β-环柠檬醛(0.16%～0.43%)等。水杨酸甲酯具有浓烈的冬青油香，对茶叶的清香具有一定贡献，在鲜叶中相对含量达7.17%，揉捻结束增至11.92%，发酵后稍有降低。二氢猕猴桃内酯具典型的烘烤香、坚果香，也是红茶的主要香气成分。但在鲜叶和萎凋叶中均未检测到此物质，仅在揉捻和发酵工序中观察到其相对含量呈上升趋势，猜测可能是揉捻和发酵过程中胡萝卜素的降解引起了二氢猕猴桃内酯的生成和相对含量的增加。苯甲醛通常表现为苦杏仁味，在加工过程中含量逐渐升高，但其阈值较高(350～3 500 μg/L)，对红茶香气品质的贡献仍需进一步研究[22]。

表1 红茶加工过程中主要香气组分的变化 单位：%

Table 1 Changes of main aroma components in black tea during processing

注：-表示未检出，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.3.3 烯烃类、酮类、烷烃类和其他组分变化的变化分析

烯烃属不饱和烃类物质，广泛存在于植物体内，具有一定的香气，对茶叶香型形成有较大影响[23]。黄金茶红茶加工中，相对含量较高的萜烯类有α-法尼烯(0.18%～0.81%)、(-)-α-荜澄茄油烯(0.17%～0.55%)等，这2类物质常表现为花香、木香[24]。酮类化合物通常具有花香味，是赋予红茶花香特征的物质基础。顺茉莉酮、β-紫罗酮等是红茶的特征香气成分之一，在本研究中顺茉莉酮、β-紫罗酮的相对含量分别为(0.1%～0.14%)、(0.35%～0.99%)。β-紫罗酮具有紫罗兰香气，主要由胡萝卜素氧化降解和热氧化降解产生[25]；鲜叶中，β-紫罗酮的相对含量为0.35%，在后续加工过程中呈逐渐上升状态。表现为强烈而愉快的茉莉香的顺茉莉酮，在揉捻叶中相对含量最高，随后略有下降。AI等[26]的研究表明，在红茶萎凋过程中补充红、橙、黄光可明显提高酮类香气物质的含量。其他被检测到的香气组分有2-甲基十四烷、正十三烷等烷烃类物质及苯乙腈、咖啡碱、(+)-香豆素，这些物质也对红茶香气的形成有一定作用。

3 结论

茶叶香气品质的形成与加工过程中关键酶的活性变化密切相关，本研究对黄金茶红茶加工过程中β-GC、LOX、ADH活性变化和香气成分的动态变化研究显示，在黄金茶红茶加工过程中β-GC、LOX、ADH的活性均呈现先增加后降低的趋势，且峰值均出现在萎凋工序；经SPME/GC-MS检测分析，共检测到263种香气组分，包括53种醇、53种烯烃、70种烷烃、36种酯、14种酮、17种醛和20种其他类化合物，其中醇类和酯类物质是主要的香气种类；此外，在47种主要的香气组分中，11种在加工过程中相对含量逐渐升高，12种在加工过程中相对含量降低，24种香气组分均呈不规则的变化趋势；相对含量较高的香气组分有苯乙醇、香叶醇、反式-橙花叔醇、芳樟醇、水杨酸甲酯、(4E)-4E-己酸己酯、二氢猕猴桃内酯、苯甲醛、反-2-辛烯醛、庚二烯醛、β-环柠檬醛、α-法尼烯、(-)-α-荜澄茄油烯、顺茉莉酮、β-紫罗酮等，且黄金茶红茶的香型可能属于芳樟醇及其氧化物主导型。在接下来的研究工作中，应精确定量分析各香气组分变化以及应用组学技术深入探究香气组分与相关酶活变化的关系，进而为黄金茶红茶的香气品质调控提供理论支撑。