酸豆奶发酵过程中大豆异黄酮及风味物质变化规律

酸豆奶是指以大豆为主要原料经过乳酸菌发酵后所得的产品[1]，大豆是一种优质植物蛋白，不含乳糖和胆固醇，是多不饱和脂肪酸以及异黄酮的丰富来源。大量研究表明，豆浆经过乳酸菌发酵后，不仅保留了原有的优良品质，还能改善不良风味，增加苷元型大豆异黄酮的含量，赋予了产品更高的生理效价，具有发酵酸牛奶不可比拟的优点[2-7]。

随着膳食结构的调整，植物基酸奶在市场上逐渐表现出强劲的势头，酸豆奶成为各大高校、科研院、企业的研究热点。近年来市面上也出现了酸豆奶系列产品，但总体上其感官品质与牛奶酸奶相比仍存在差距。原因有二，一是酸豆奶存在豆腥味、苦涩味等一系列不良风味；二是酸豆奶的质地呈“豆腐状”，与牛奶酸奶的柔滑糊状质构差距较大，且存在后酸化，持水能力差等问题。不良风味与质构是影响酸豆奶产品品质的关键因素，如果能够将不良风味和质构极大改善，对酸豆奶的发展具有重要研究意义。

本文利用HPLC测定酸豆奶发酵过程中大豆异黄酮变化规律，结合气相色谱-三重四级杆质谱联用仪(GC-MS/MS)技术分析酸豆奶发酵过程中挥发性物质的成分种类及含量变化情况，为更好地研究酸豆奶发酵工艺解决豆腥味、苦涩味等难题提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

大豆为市售东北大豆；鼠李糖乳杆菌KJY-HN001-01-01由豆制品加工与安全控制湖南省重点实验室提供；蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、葡萄糖均为国产分析纯，北京奥博星生物技术有限责任公司；硫酸镁、硫酸锰、磷酸氢二钾、醋酸钠、二水柠檬酸钠均为国产分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；琼脂，上海伊卡生物技术有限公司；蔗糖、乳糖、葡萄糖，均为食品级，欣烁生物科技有限公司；大豆苷(daidzin)、大豆苷元(daidzein)、染料木苷(genistin)、染料木素(genistein)、黄豆黄苷(glycitin)、黄豆黄素(glycitein)标准品，北京索莱宝科技有限公司；甲醇、乙腈均为国产色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

IS-RDD3 型台式恒温振荡器，苏州捷美电子有限公司；SB-5200DTD 型超声清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；RE-5299 型旋转蒸发器，巩义市予华有限责任公司；VELOCITY18R 型高速冷冻离心机，澳大利亚Dynamica公司；ULtiMate3000 型高效液相色谱仪，安捷伦公司；TQ8040三重四级杆气质联用仪，日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株活化

乳酸菌接种于MRS液体培养基(121 ℃灭菌15 min)中，37 ℃培养24 h，活化至3代，采用平板计数法得到活菌数为1×108CFU/mL 的菌液，备用。

1.2.2 酸豆奶制备

大豆清洗浸泡后通过二次浆渣共熟工艺制成豆浆，经过前期预实验，从中选取对酸豆奶影响最为显著的3种碳源蔗糖、乳糖、葡萄糖。按照表1添加灭菌后(105 ℃，8 min)的碳源，按30 mL/L菌液接种量接种于豆浆中，37 ℃恒温培养箱中发酵成酸豆奶。

1.2.3 酸度测定

参照 GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》。

1.2.4 感官评价

评定小组由经过培训的10名食品专业学生组成，分别从滋味、气味、质构、色泽、综合接受程度5个方面进行感官评定,如表2所示。

表1 不同碳源及其比例 单位：g/mL

Table 1 Different carbon sources and proportions

表2 感官评价表
Table 2 Sensory evaluation table

1.2.5 HPLC测定大豆异黄酮

参照 GB/T 26625—2011《粮油检验 大豆异黄酮 高效液含量测定 高效液相色谱法》，做一定调整[8]。取15.00 g酸豆奶于50 mL具塞比色管中，加入80%甲醇溶液定容。超声处理1 h(超声功率288 W，温度40 ℃)，高速冷冻离心机10 000 r/min 离心10 min。取上清液转入旋转蒸发仪中浓缩至10 mL，用10%甲醇定容。均匀取2 mL样品过0.45 μm有机系滤膜，利用HPLC测定。液相色谱条件：流动相 A 为 0.1%乙酸溶液、流动相 B 为 0.1%乙酸乙腈溶液、波长 260 nm、流速 1 mL/min、柱温 40 ℃、进样量 20 μL。

1.2.6 GC-MS/MS测定挥发性风味物质

取酸豆奶样品5 mL，在高速冷冻离心机10 000 r/min内离心10 min。均匀取2 mL上清液样品过0.22 μm水系滤膜，进入系统测定。色谱条件：HP-5MS型石英毛细管色谱柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为高纯氦气；不分流进样；进样口温度设定为280 ℃；程序起始温度设定为40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至190 ℃，保持10 min， 然后以8 ℃/min升至240 ℃，保持15 min。质谱条件：电子电离源(electron ionization, EI)；电子能量为70 eV；离子源温度为250 ℃；接口温度为280 ℃；扫描范围为45～500 m/z。参照参考文献[9]做一定调整。

1.2.7 定性定量方法

利用计算机比对测试样品对照标准谱库(National Institute of Standards and Technology, NIST)的质谱数据进行成分鉴定，仅报道相似指数(similar index)和反相似指数(reverse similar index)均大于800的物质。化合物相对含量按总离子图峰面积归一化计算。

1.3 数据处理

实验结果数据每组重复3次，数据采用Excel 2017、Origin 2018 和 IBM SPSS Statistics 22.0 进行图像绘制及处理。

2 结果与分析

2.1 不同碳源及其比例对酸豆奶酸度的影响

由图1可知，在发酵过程中，对照组酸豆奶的酸度虽随着发酵时间延长而增加，但增幅明显较低(P<0.01)，发酵终点酸度仅有(30.98±0.46)oT。添加同一碳源蔗糖、乳糖酸豆奶的酸度，随着碳源比例的增加，酸度呈上升趋势(P<0.05)；添加葡萄糖酸豆奶的酸度，呈现倒U型趋势，在0.02 g/mL添加量时，酸度最高。到达发酵终点时，添加0.01、0.02、0.03 g/mL的蔗糖、乳糖、葡萄糖的酸度分别是(37.97±0.26)、(39.12±1.14)、(48.82±1.13)°T和(39.37±0.54)、(43.37±1.67)、(47.75±1.39)°T 和(44.50±0.40)、(48.35±0.87)、(46.04±1.24)°T。不同碳源在相同添加比例条件下酸度也有显著区别。0.03 g/mL添加量的蔗糖、乳糖酸豆奶酸度显著高于其他两种比例(P<0.05)，0.02 g/mL添加量葡萄糖显著高于其他两种比例(P<0.05)。

豆浆中的碳水化合物主要是棉籽糖、水苏糖、蔗糖等低聚糖，缺少乳酸菌能利用的能源物质，导致乳酸菌活力低、产酸低。向豆奶中添加一定量的蔗糖、葡萄糖、乳糖等能源物质可以促进乳酸菌发酵[4]。周艳平等[4]研究发现不同碳源蔗糖、乳糖、葡萄糖制备的大豆酸奶，达到相同发酵终点时，酸度差异较大，变化范围在43～47 °T，这与本文研究结果相似。王浩[10]研究发现向豆浆中添加0.5%的乳糖制备的大豆酸奶的口感风味较好，并且乳糖能够很好的促进乳酸菌在豆浆中的产酸。张秋香等[11]在对乳酸菌利用不同低聚糖研究发现，乳酸菌对不同低聚糖的利用特性不同，产酸速率也不同，造成这种现象的根本原因是乳酸菌对不同糖类物质代谢途径不同[12]。

图1 不同碳源及其比例对酸度的影响
Fig.1 Effects of kinds and proportions of carbon sources on acidity

2.2 不同碳源及其比例对酸豆奶感官评价的影响

由表3可知，增加不同碳源蔗糖、乳糖、葡萄糖的比例会显著提升酸豆奶滋味、气味、综合接受程度方面感官评分(P<0.05)，对质构和色泽方面评分无显著影响(P<0.05)。随着葡萄糖比例增加，酸豆奶豆香味愈发浓郁，豆馊味变弱，入口滋味香甜，但仍有轻微涩口感；蔗糖比例增加，酸豆奶豆香味最浓，豆腥味最轻，几乎没有豆馊味，入口滋味口感酸甜适口，涩味最弱；随着乳糖比例增加，酸豆奶豆香味较浓，仍有微弱豆馊味、豆腥味存在，入口滋味口感适中，苦涩味明显。结果表明，不同碳源对酸豆奶感官品质有明显影响，同一碳源不同添加比例对酸豆奶感官品质也有显著影响，其中添加0.03 g/mL蔗糖、乳糖、葡萄糖酸豆奶滋味、气味、综合接受程度方面感官评分最高。这可能是由于乳酸菌只能利用豆浆中一小部分低聚糖而导致菌种繁殖速率过低、产酸、产香不够，随着碳源蔗糖、乳糖、葡萄糖比例的增加，乳酸菌代谢糖类的能力增加，产品感官品质也随着提升。王浩[10]发现添加乳糖的酸豆奶在酸度和感官评价各方面均表现更优秀，周艳平等[4]研究发现不同碳源蔗糖、乳糖、葡萄糖制备的大豆酸奶的豆腥味风味物质含量较少，而酸类、酮类等酸奶香气的典型化合物含量较多，这一结果表明额外添加碳源蔗糖、乳糖、葡萄糖的酸豆奶，其产品的滋味和气味等更佳，这均与本文研究结果相似。而表中质构和色泽评分无显著影响，原因可能是仅通过肉眼感官观察无法判断质构和色泽细微的差别，若采用质构仪和色差仪测量，可能会出现不同结果。

表3 不同碳源及其比例对感官评价的影响
Table 3 Effect of different carbon sources and their proportions on the sensory evaluation

2.3 酸豆奶发酵过程中大豆异黄酮变化规律

发酵过程中在乳酸菌中β-葡萄糖苷酶的作用下大豆异黄酮的组分和含量发生了改变，β-葡萄糖苷酶可以将糖苷型异黄酮转化为生理活性更高的苷元型异黄酮。未发酵前大豆异黄酮主要是结合型糖苷，发酵后糖苷型含量减少，游离型苷元增加[13]，同时产生了一系列代谢产物[14]。经过前期碳源优化实验得到3种碳源的最优添加比例为0.03 g/mL，后期大豆异黄酮变化规律实验设计为添加0.03 g/mL的蔗糖、乳糖、葡萄糖。

图2可知，0 h酸豆奶中大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素含量分别为(67.70±0.69)、(135.15±2.25)、(0.11±0.02)、(2.76±0.16) mg/kg。经过微生物发酵之后，不额外添加碳源的酸豆奶，其大豆苷、染料木苷含量减少至(12.65±0.84) mg/kg和(42.33±1.24) mg/kg，添加0.03 g/mL的蔗糖、乳糖、葡萄糖碳源的酸豆奶，糖苷型异黄酮整体呈大幅下降趋势，大豆苷、染料木苷含量分别减少至(6.26±0.14)、(32.80±1.25) mg/kg和(21.48±0.68)、(36.58±0.57) mg/kg和(4.99±0.05)、(16.04±0.1) mg/kg，其中添加0.03 g/mL葡萄糖的酸豆奶糖苷型异黄酮下降率最高，达92.62%和88.13%。结果表明，外加碳源的酸豆奶其糖苷型异黄酮下降率与对照组差异显著(P<0.05)。这可能是因为碳源会影响乳酸菌的生长代谢，合适的碳源可以促进乳酸菌的生长，増强β-葡萄糖苷酶活性，促进糖苷型异黄酮的转化。周帆[15]研究发现4%～8%的乳糖更适合植物乳杆菌58的生长，β-葡萄糖苷酶活性显著增加，能够高效率转化苷元型异黄酮。TSANGLIS等[16]发现外加1%葡萄糖辅助4种双歧杆菌发酵豆乳，苷元型大豆异黄酮含量均有不同程度的增加。

此外不同碳源之间的糖苷型异黄酮下降率差异显著，外加葡萄糖的效果明显优于其他两种碳源(P<0.05)。添加0.03 g/mL蔗糖的酸豆奶苷元型异黄酮含量增加至(14.02±0.84)mg/kg和(11.10±0.51)mg/kg，添加0.03 g/mL乳糖、葡萄糖的酸豆奶苷元型异黄酮含量未有显著变化(P>0.05)。造成这种现象的原因可能一是发酵时间不够，在取样时间点时苷元型异黄酮尚未被完全转化，导致苷元型异黄酮含量较低；二是乳酸菌可能优先利用蔗糖，提高了β-葡萄糖苷酶的活性，苷元型大豆异黄酮含量主要由发酵过程中乳酸菌的β-葡萄糖苷酶活性决定[17]，最终导致在9 h时0.03 g/mL葡萄糖添加量的酸豆奶大豆苷元和染料木素含量显著增加(P<0.01)。朱亚军[18]研究发现，不同乳酸菌菌种和同种乳酸菌不同菌株转化大豆异黄酮的时间和含量均有显著差异(P<0.05)。是否优先利用蔗糖、葡萄糖等情况也不相同。

a-对照组；b-添加0.03 g/mL蔗糖；c-添加0.03 g/mL乳糖；d-添加0.03 g/mL葡萄糖
图2 碳源对酸豆奶大豆异黄酮的影响
Fig.2 Effect of carbon sources on isoflavones in fermented soybean milk

2.4 酸豆奶挥发性风味物质变化规律

风味物质是指一类能够赋予食品风味的物质组成，包含气味和滋味，是由一系列挥发性物质和非挥发性物质共同组成[1]。在发酵过程中，乳酸菌通过代谢碳水化合物、蛋白质等一系列生物化学过程形成挥发性风味物质。在糖酵解途径中，乳酸菌将葡萄糖转化为丙酮酸，进而通过EMP(Embden-Meyerhof-Parnas pathway)途径、HMP(hexose monophophate pathway)途径及HK(phosphate hexoglycolketoenzyme pathway)途径等多种代谢途径产生醛类、酮类、酸类和醇类等化合物；在蛋白质水解途径中，通过蛋白酶分解蛋白质形成肽类和氨基酸等多种代谢物，其中部分氨基酸等小分子物质进一步形成挥发性芳香化合物[19]。在不同发酵时间内主要挥发性风味物质相对含量的变化情况如图3所示，酸豆奶在发酵过程中所测得挥发性风味物质的种类和数量如表4所示。

图3 不同发酵时间挥发性风味物质相对含量变化
Fig.3 Relative content changes of volatile flavor substances at different fermentation times

表4 酸豆奶挥发性化合物数量单位：种

Table 4 Statistics of volatile compounds in fermented soybean milk

由表5可知，在发酵过程中共鉴定出72种化合物，包括酯类17种、酸类16种、酮类15种、醇类11种、醛类4种、酚类3种、烷烃1种、烯烃1种、其他类4种。不同发酵时间检测挥发性化合物种类有差别且挥发性物质含量存在显著差异(P<0.05)。豆奶中1,2-庚二醇、2,3-丁二醇、1-辛烯-3-醇占主要比例，在微生物的代谢作用下，这些不愉快的风味物质都被代谢到较低或检测不到的水平，并且形成了新的酸类、酮类、酯类和醛类等风味物质。酸豆奶发酵前后在风味物质构成成分、相对含量上差异较大，醛类、酮类、酯类、酚类化合物含量及种类明显增加，酸类含量和种类先增加后减少，但醇类明显减少。

醛类化合物主要来自脂肪酸的氧化分解，一般气味阈值较低对整体的气味贡献特别大。醛类在发酵过程中可以被氧化或还原为各自的酸或醇，醇类物质与酸类物质能够形成酯类物质。而醛类化合物在发酵后期含量仍居高不下的原因主要是5-羟甲基糠醛含量在醛类占较高比例，造成此种现象的原因可能是发酵乳在高温加热过程中发生美拉德反应所致，且糖含量(葡萄糖、乳糖、蔗糖、半乳糖)可显著影响5-羟甲基糠醛的累积[20]。酮类物质通常给整体风味带来愉悦感，随着发酵时间延长酮类物质的种类和含量增加，如2,3-丁二酮、2,3-戊二酮等物质含量的累积，酸豆奶整体的风味也呈现令人愉悦的奶油、干酪香气。醇类物质的含量和种类在发酵过程中明显减少，1-庚醇、1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇、2,3-丁二醇等具有蘑菇味、青菜味、油漆味的特征不良风味物质含量显著减少。酯类化合物也是构成香气的重要物质之一，乙酸乙酯具有醚香、甜的果香[21]，这些酯类的存在带来了馥郁的香味。挥发性酸类物质是由乳酸菌代谢过程中产生的，酸类物质中占主要比例的是甲酸、乙酸、3-甲基-2-富马酸、α-酮戊二酸，这些酸类物质能给整体风味增加层次感。

表5 酸豆奶风味物质相对含量 单位：%

Table 5 Fermented soybean milk flavor substances

续表5

3 结论与讨论

本研究通过添加不同比例的蔗糖、乳糖、葡萄糖碳源，探究在不同碳源及其比例的条件下，酸豆奶发酵过程中底物利用情况以及大豆异黄酮代谢和风味物质变化规律。结果表明，向豆奶中额外添加蔗糖、葡萄糖、乳糖等碳源能有效促进乳酸菌产酸，缩短酸豆奶凝乳时间，不同碳源促进产酸效果不同，同一碳源不同比例促进产酸效果也不同。添加一定量的蔗糖、葡萄糖、乳糖等能源物质不仅可以促进乳酸菌发酵产酸，还可以提升酸豆奶产品感官品质。碳源对酸豆奶感官品质有明显影响，碳源相同添加比例不同对酸豆奶感官品质影响也显著。另外碳源对发酵酸豆奶异黄酮组分和含量影响差异显著，外加葡萄糖转化糖苷型异黄酮的效果明显优于其他两种碳源(P<0.05)，外加蔗糖对增加苷元型异黄酮的效果明显优于其他两种碳源(P<0.05)。酸豆奶中共鉴定出72种化合物，包括酯类17种、酸类16种、酮类15种、醇类11种、醛类4种、酚类3种、烷烃1种、烯烃1种、其他4种。不同发酵时间检测挥发性化合物种类有差别且挥发性物质含量存在显著差异(P<0.05)。