低温低功率等离子体处理对复合蛋白基薄膜结构性能的影响

蛋白质基薄膜被认为是食品包装开发中最有潜力的生物可降解聚合物，因为蛋白质紧密的空间构象使得其具有高于普通塑料膜的阻隔性能，能够很好地保护食品不受外界气体和水分渗入的影响而发生氧化和腐败，从而延长食品的保质期[1]。本文大量的前期研究工作发现乳清分离蛋白-酪蛋白酸钠复合蛋白膜是一类具有高强度、高阻隔性的相对较为疏水的可食性薄膜[2]。为了强化其结构稳定性、改善薄膜拉伸性能和对水分的敏感性，前期采用了不同方式对复合蛋白膜进行改性，如在成膜溶液中加入多糖的方式，构建蛋白质-多糖美拉德反应体系，显著提高了薄膜疏水性和阻隔性能，并使薄膜具备了一定的抗氧化特性此外，通过使用静态超高压、等离子体处理成膜溶液所制备而得的复合蛋白膜也呈现出更加优良的成膜特性[3-5]。

等离子体可分为高温等离子体和低温等离子体。处于核聚变状态的物质、电弧、闪电、极光等都是高温等离子体，高温等离子体在切割、冶炼、焊接等领域都有广泛的应用。低温等离子体技术是一种能够对敏感材料进行灭菌和改性的新兴非热技术，能够利用放电产生的自由基、电子、正负离子、原子和分子的激发态或基态以及紫外线光子等物质，通过刻蚀、交联和氧化反应来温和地修饰蛋白质的结构[6]。因此，低温等离子体技术被视为物理、化学和光化学修饰技术的组合体[7]。低温等离子体技术作为一种材料表面处理技术，在不损伤材料本身性能的情况下能够有效提高聚合物的黏合性和功能性，如，低温等离子体在放电过程中轰击薄膜表面，会导致其形态在微米到纳米范围内发生巨大变化，同时会使晶体含量和位置改变，薄膜结构中的活性基团异变，最终对薄膜表面粗糙度、油墨附着力、机械性能、阻隔性能、接触角和生物降解性产生一定程度的影响作用[1, 8-9]。PANKAJ等[10]研究结果显示，低温等离子体处理明胶薄膜后增加了薄膜表面粗糙度，并且粗糙度取决于等离子体的处理时间。输入的功率对等离子体处理的效率有很大影响，较低功率的等离子体处理可以减小实验过程中形成的臭氧以及氮氧化合物对聚合物产生的过度氧化[11]。除此之外，等离子体处理过程中，由于活性氧的累积而产生氧化反应，使得细菌细胞膜破裂死亡，这也赋予了等离子体技术在一定条件下具有高于一般灭菌技术效率的能力[12-13]。

为此，为了深入探究低温低功率等离子体处理技术在蛋白基薄膜成膜工艺中的应用，开发其潜在的功能特性，本文拟在前期对复合蛋白基成膜溶液等离子处理的研究基础上[3]，进一步对成型薄膜进行不同程度的低温等离子体处理，通过分析薄膜蛋白质二级结构变化、微观形态、热稳定性、表面亲水性和亲油性、机械性能、阻隔性能以及灭菌能力的变化，进一步提升复合蛋白基薄膜性能的改良空间，以力图使其适应于现代食品包装的产业化生产及应用，同时，也为低温等离子体技术在食品工业中的应用潜力提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

乳清分离蛋白粉(蛋白质>98%)，美国ISOPURE公司；酪蛋白酸钠(蛋白>99.21%)，上海麦克林生化科技有限公司；丙三醇(甘油，分析纯)，上海麦克林生化科技有限公司；去离子水，自制。

1.2 实验仪器

Piezobrush PZ2等离子处理仪，德国RP plasma公司；T25数显型高速分散机，德国艾卡公司；PERMATRAN-W Model 1/50G水蒸气透过率测试仪、OX-TRAN 2/21氧气透过率测试仪，美国MECON有限公司；XLW(EC)型智能电子拉力试验机，济南蓝光机电技术有限公司；JC2000C接触角测量仪，上海中晨数字技术设备有限公司；SU5000热场发射扫描电镜，日本日立高新技术公司；Q2000差示扫描量热仪，美国TA仪器公司；Nicolet iS10傅立叶红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；WGT/S透光率/雾度测定仪，上海精科仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 薄膜制备及等离子体处理方法

称量24 g 乳清分离蛋白粉、16 g酪蛋白酸钠粉末分别溶解于400 mL去离子水中。溶液于室温下搅拌60 min混合均匀后升温至85 ℃同时连续搅拌30 min以使蛋白变性。溶液冷却至室温后加入14 g甘油，室温下搅拌均匀，真空脱气后，将溶液等量倒入制膜容器中，置于65 ℃鼓风干燥箱中干燥5 h，薄膜成型后揭下。使用等离子体处理仪对在距离薄膜1.5 cm处对大小为5 cm×5 cm薄膜表面进行5、10、15、20 min的处理。最后，薄膜置于23 ℃、50%相对湿度(relative humidity，RH)的恒温恒湿箱中放置待测[3]。

1.3.2 傅立叶红外光谱扫描

利用傅立叶红外光谱研究蛋白质的结构和分子间的相互作用。在4 cm-1的分辨率下，从4 000到500 cm-1扫描所有薄膜16次，并通过Omnic 8.0软件分析光谱[14]。

1.3.3 电镜扫描(scanning electron microscope，SEM)

通过SEM拍摄等离子体处理后薄膜的表面微观形态。通过将样品胶粘到样品台上，喷金以提高图像分辨率和对比度，在6 kV的加速电压分析薄膜表面微观形态[15]。

1.3.4 差示扫描量热(differential scanning calorimetry，DSC)

称量薄膜样品(约5 mg)，在氮气保护下(吹扫气流为20 mL/min)，以10 ℃/min的加热速率从0 ℃到225 ℃进行分析，使用Universal analysis 2000软件对图形和数据进行处理[14]。

1.3.5 表面接触角测量

室温下，裁剪3 cm×3 cm薄膜置于悬滴液下0.5 cm处，向薄膜表面滴约3 μm的液体，并用相机记录图像，用ImageJ软件对获取的图像进行分析[16]。

1.3.6 机械性能测定

裁剪1.5 cm宽和5 cm长的薄膜样品固定于智能电子拉力机夹具之间。初始夹距为50 mm，拉伸速度设置为300 mm/min，持续施加拉力直到薄膜断裂。记录样品拉伸强度和断裂伸长率[16]。

1.3.7 阻隔性能测定

利用红外法测量样品的水蒸气透过率，设置水蒸气透过率测量仪参数：样品两侧湿度差为90%，测试温度为25 ℃。测量结束记录样品水蒸气透过率并计算水蒸气透过系数[2]。

氧气透过率测试是根据PANKAJ等[16]实验仪器参数进行修改，用样品切割工具对样品进行剪裁成50 cm2的样品待用，在环境温度为23 ℃下进行测试。

1.3.8 光学性能测定

裁剪样品膜4 cm×4 cm，置于透光测试仪的夹具上，使仪器发射出的光束垂直透过样品膜，记录薄膜透光率和雾度值[3]。

1.3.9 水溶性测定

裁剪样品膜3 cm×3 cm， 105 ℃烘干24 h，记录初始质量m1。在室温下，将薄膜浸入放有50 mL蒸馏水的烧杯中，静置1 d。取出未溶解的薄膜样品，并于105 ℃烘箱中干燥，称量直至恒重(0.000 2 g)，最终质量记为m2(g)。薄膜水溶性(water solubility，WS)根据公式(1)计算而得[3]：

(1)

1.3.10 等离子体处理薄膜菌落总数测定

根据GB 4789.2—2016[17]分别对处理时间为0、5、10、15、20 min薄膜菌落总数测定。

1.3.11 统计分析

采用Origin 2019b进行作图分析，使用SPSS 20.0 软件对数据进行统计处理，概率值的P<0.05被认为是显著的，利用Omnic软件(OMNIC 8.0)和Peakfit v4.12分析样品的光谱图。

2 结果与分析

2.1 薄膜的傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)分析

采用FTIR表征等离子体处理薄膜前后的蛋白质二级结构变化，如图1所示。结果显示，不同等离子体处理的蛋白薄膜样品均呈现出相似的红外光谱，说明在等离子体放电过程中，官能团在不同的处理时间及强度条件下，能够基本维持稳定。由于位于1 600～1 700 cm-1的酰胺I带(CO拉伸振动)是蛋白质构架中最突出和最敏感的振动带，并且与蛋白质二级结构有关，因此，对酰胺I带进行分峰拟合计算二级结构百分比，通过傅里叶自去卷积、高斯二阶拟合和计算(表1)，其中，α-螺旋在1 650～1 660 cm-1处，β-折叠在1 610～1 640 cm-1处，β-转角在1 660～1 700 cm-1处，无规则卷曲在1 640～1 650 cm-1处[18]。

图1 不同时长等离子体处理的薄膜FTIR光谱
Fig.1 FTIR spectra of films treated with plasma for different durations

由表1可知，等离子体处理会对薄膜蛋白质二级结构含量产生波动性影响，当等离子体处理10 min后，α-螺旋的百分比从16.47%逐渐升至19.12%，提高了16.10%，而β-折叠的百分比由未处理的37.70%升高至43.04%，提高了14.16 %，随着处理时间延长至20 min，α-螺旋百分比减少至17.04%，降低了10.87%，β-折叠的百分比减少至41.97%，降低了2.4%。可以看出，α-螺旋百分比的变化速率要高于β-折叠百分比的变化速率，并且两者都在短时间较低能率等离子体处理过程中百分比变化幅度更大。此外，数据显示在等离子体处理过程中，β-转角和无规则卷曲所占百分比都呈现出下降趋势。

上述变化显示出，复合蛋白基薄膜的有序结构被等离子体放电处理所改变，这归因于等离子体放电过程中产生的活性氧和活性氮的作用，对氢键产生影响，导致每个结构发生少量变化[19]。由于α-螺旋比例的提高可能会在蛋白质结构中引入二硫键，因此蛋白膜结构更加稳定，同时，β-折叠程度的增加也稳定了蛋白质结构，说明了较低能率等离子体处理可以提高蛋白膜的稳定性[20]。DONG等[6]也发现了相似的变化。

表1 不同时长等离子体处理的薄膜蛋白质二级结构百分比组分变化
Table 1 Percentage of the secondary structure of films treated with plasma for different durations

2.2 表面微观结构变化

如图2所示，未经等离子体处理的蛋白膜表面光滑，有轻微的空洞，在处理5 min后空洞逐渐消失，开始出现细微的突起，这可能是由于蛋白质聚合导致的；当10 min等离子体轰击薄膜后，薄膜吸收能量使得表面孔洞完全消失，粗糙度增加，颗粒感更加明显。根据PANKAJ等[21]的报道，物理刻蚀(物理除去低分子碎片)和化学刻蚀(键的断裂，断链，化学降解)是造成刻蚀发生的主要原因。由于等离子体处理产生刻蚀效果，导致薄膜表面更为粗糙；而经过15～20 min等离子体处理后，薄膜出现了较大、较多的孔洞，且随着处理时间的延长，孔洞变多，该现象的发生与高能率等离子体处理过程中过于剧烈的刻蚀反应有关，这与PANKAJ等[10]研究有相似之处。

a-放大7 000倍电镜图；b-放大1 000倍电镜图
图2 不同时长等离子体处理的薄膜表面电镜图
Fig.2 SEM images of surfaces of films treated with plasma for different durations

2.3 热性能分析

薄膜的热流密度与温度之间的变化关系如图3所示，不同时长等离子体处理后的复合蛋白膜的玻璃态转变温度(Tg)、热分解温度(Td)和焓变值(ΔH)如表2所示。从DSC热分析图和表2中数据可以看出，等离子体处理经过5和10 min后，Tg分别由145.56 ℃升至148.07 ℃和150.60 ℃。但是，随着等离子处理时间延长至20 min，Tg又降低至143.84 ℃，这显示可能存在某种结构退化。这一观察结果与FTIR结果一致：处理5和10 min样品中较高的α-螺旋和β-折叠结构表明蛋白质形成了更规则有序的结构，结晶度提高，因而蛋白质链的移动受到限制使得Tg升高。然而，当等离子处理时间延长到20 min，等离子体放出能量进一步升高，继而会引发化学刻蚀和蛋白质链断裂，从而导致自由体积的增加并降低玻璃态转变温度[10]。

由图3和表2可知，对照未进行等离子体处理薄膜的Td约为183.71 ℃，处理了10 min的复合蛋白膜Td提升了约73%，而在延长等离子体处理时间时，薄膜Td下降至191.35 ℃(20 min)，这可能与等离子释放出的不同能量使得蛋白质聚集程度变化有关。与此同时，还观察到处理时间延长会降低分解峰的强度及其焓值，MIAO等[22]观察到了相同的趋势。因此判断较低能率等离子体处理能够增加β-折叠和α-螺旋的含量，进而提高薄膜的热稳定性。

2.4 机械性能的变化

等离子体处理时间对复合蛋白膜机械性能的影响如表3所示。

图3 不同时长等离子体处理的薄膜DSC热分析图
Fig.3 DSC thermogram of films treated with plasma for different durations

表2 不同时长等离子体处理的薄膜样品的热力学参数
Table 2 Thermodynamic parameters of films treated with plasma for different durations

由表3可知，随着等离子体处理时间的延长，抗拉强度呈先上升后下降的趋势，在处理10 min时抗拉强度显著增大至12.46 MPa(P<0.05)，而后逐渐降低至7.72 MPa，而薄膜的断裂伸长率与抗拉强度的变化则与之呈相反的趋势。在等离子体处理过程中，基于材料表面吸收的能量和等离子体产生的反应物质，聚合物结构中会发生降解，官能化，刻蚀和交联等反应[23]。其中，抗拉强度的增加与断裂伸长率的减小可能是由于等离子体在轰击蛋白薄膜时，产生的自由基与薄膜表面自由基发生链反应，清除了大量低分子质量碎片，使得薄膜的抗拉强度有显著提升[23]。而处理15～20 min时，薄膜抗拉强度降低，断裂伸长率升高，这是由于长时间、较高能率离子体处理过程中，通过官能化反应将含有氧或氮自由基的官能团引入聚合物表面，导致聚合物网络中自由体积的增加，形成了许多松散的低分子质量有机分子[8]。除此之外，等离子体可能导致了过氧化物、羟基和羧酸的形成，它们对薄膜柔韧性起到一定的影响作用，这也解释了抗拉强度和断裂伸长率变化的原因[24]。

2.5 阻隔性能的变化

表3中水蒸气透过系数和氧气透过率数值显示，与未经等离子体处理的薄膜相比，等离子体处理5～10 min可显著降低水蒸气透过率和氧气透过系数(P<0.05)，即，阻隔性显著提高，水蒸气渗透系数由未处理的6.51×10-12 g·cm/(cm2·s·Pa)降低至10 min后的5.555×10-12 g·cm/(cm2·s·Pa)，降低了14.67%，氧气透过率由2.065 cm3/(m2·d)降低至1.20 cm3/(m2·d)，降低了41.80%。而处理15～20 min后，相较于未处理的薄膜，薄膜水蒸气透过系数和氧气透过率分别升高了8.90%和160.05%。

表3 等离子体处理的薄膜机械性能、氧气透过率和水蒸气渗透系数数据
Table 3 Datas of mechanical properties, oxygen permeability and water vapor permeability of films treated with plasma for different durations

水蒸气和氧气的渗透性是选择任何食品包装材料的关键参数。水蒸气的渗透取决于聚合物2个表面上的蒸气压和浓度梯度，这取决于扩散和溶解机理。气体渗透率也是扩散和溶解度的综合作用，其中渗透物通过聚合物链各段之间存在的间隙的空隙进行传输[25]。等离子体处理后交联的产生是改善薄膜的阻隔性能的一个原因，聚合物链之间的交联量的增加导致聚合物链之间的自由体积减小，因此减少了水和氧分子的扩散，同时，在等离子体处理后，由于等离子体中高度激发的离子，电子和分子而形成的分子间和链间键也导致可生物降解膜对阻隔性能提高[26]。此外，等离子体处理后随着聚合物极性的增加，内聚能密度增加，使渗透物质更难打开聚合物链并渗透，使得薄膜阻隔性能提升[27]。在更长的等离子处理时间(15～20 min)下，等离子体释放的更高能量使得刻蚀反应剧烈，水蒸气和氧气分子的渗透变得容易，从而导致较差的阻隔性能。

2.6 接触角的变化

图4显示了不同时长等离子体处理对复合蛋白膜的水、油润湿性的影响。等离子体处理10 min后，复合蛋白膜的水接触角(water contact angle，WCA)显著降低了9.18%，从68.99°降至62.654°(P<0.05)。延长等离子体处理时间，其WCA值进一步降低至54.91°，油接触角(oil contact angle，OCA)也显著降低至39.41°(P<0.05)。这表明等离子体显著增强了复合蛋白基膜的表面亲水性和亲油性(P<0.05)，造成这种现象可能的原因如下：一方面等离子体的刻蚀反应导致了薄膜粗糙的表面微观结构(如SEM显微照片所示)[9]。此外，除了刻蚀，通过低能率等离子体处理形成的活性极性基团也有助于提高表面张力和表面自由能(特别是极性组分)。本实验以空气为反应介质，以氧气为主要活性气体，因此，诸如羟自由基和原子氧等的活性氧可能与薄膜表面蛋白分子中氢化合物反应，从而使得表面亲水性和亲油性增加[21, 28]。如图4所示，当等离子体处理时间延长至20 min时，复合蛋白膜的WCA和OCA分别降低了20.40%和33.54%，这可能是由于高能率等离子体强烈的刻蚀作用导致其极性基团暴露于表面，进而提高了薄膜的亲水性和亲油性[29]。

图4 不同时长等离子体处理薄膜的水和油接触角
Fig.4 Water and oil contact angle of films treated by plasma for different durations

2.7 光学性能的变化

图5是不同时长等离子体处理薄膜的透光率和雾度变化图，由图5可以看出，5～10 min等离子体处理显著影响了薄膜的光学性能(P<0.05)，薄膜透光率降低了约20%，雾度提高了28%，持续延长等离子体处理时间，薄膜的透光率又有了轻微上升。该结果的产生可能是由于低能率的等离子体处理过程中，蛋白质大分子的聚集影响了光的通过，并且薄膜粗糙的表面阻碍了光的垂直透射。而高能率等离子体使得薄膜结构破坏产生微孔，又增强了薄膜的透光性[30]。

图5 不同时长等离子体处理薄膜的透光率和雾度
Fig.5 Light transmittance and haze of films treated by plasma for different durations

2.8 水溶性的变化

如图6所示，等离子体处理5～10 min后，复合蛋白膜的水溶性有轻微下降，薄膜处理10 min后水溶性降低了10%，而更长时间的处理使得其水溶性又有所上升。这是由于短时间低能率的等离子体处理使得内聚能密度增大，蛋白质分子间聚合度增加，水分子更难浸入，而薄膜表面粗糙度的增加又使得薄膜表面更加亲水，因此在低能率等离子体处理条件下，薄膜的水溶性没有大幅变化，而高能率等离子体破坏了蛋白质结构使得其极性基团暴露，增加了蛋白基薄膜对水分的敏感性[29]。

图6 不同时长等离子体处理薄膜的水溶性
Fig.6 Water solubility of films treated by plasma for different durations

2.9 薄膜菌落总数变化

表4的结果显示，等离子体处理能够有效杀灭薄膜表面的菌落：5 min处理后，薄膜表面菌落明显减少了85%，10 min后进一步降低至20 CFU/g，继续延长等离子体处理时间菌落总数都低于10 CFU/g。等离子体中反应性物质包括单线态氧、羟自由基和超氧阴离子以及过氧化氢、臭氧、亚硝酸根离子和硝酸根离子等，其中单线态氧累积产生氧化反应的同时羟自由基也能够作为最强氧化剂，破坏细菌细胞膜从而杀灭细菌。超氧阴离子可以在等离子体创造的酸性环境中转化为过氧自由基，更容易渗透到细胞壁并诱导细胞死亡[31]。

3 结论

等离子体处理时间及能率对复合蛋白膜的各项性能均存在显著影响(P<0.05)。经过短时间(5～10 min)、较低能率等离子体处理，蛋白质中α-螺旋、β-折叠的百分比上升，复合蛋白薄膜表面粗糙度上升，蛋白质结构更加有序稳定，热稳定性也明显提升，薄膜的疏水性下降，机械性能、阻隔性能都呈现上升趋势；而长时间(15～20 min)、高能率等离子体处理薄膜，等离子体过度剧烈的刻蚀反应导致薄膜出现孔洞，破坏了薄膜致密的结构，热稳定性下降，同时降低了其机械性能和阻隔性能。除此之外，等离子体处理也能够有效杀灭薄膜表面微生物。

表4 不同时长等离子体处理的薄膜菌落总数
Table 4 Total viable counts of films treated with plasma for different durations

综上所述，对复合蛋白膜进行10 min左右、低能率的等离子体处理，能够改变薄膜表面结构，提升热稳定性、机械性能、阻隔性能，降低薄膜透光性和水溶性，同时具有优良的薄膜表面的灭菌功能，满足了食品包装在食品工业中应用的加工性及安全卫生性要求，进一步拓展了绿色包装材料的研发空间，也为低温等离子体技术的多功能应用提供了可能。