温度对产香酵母产挥发性风味物质的影响

酱香型白酒是中国传统白酒的经典代表之一,其“三高三长”的酿造工艺形成了酱香型白酒独特的口感风味。其独特风味是由酵母菌、霉菌、细菌等多种微生物构成的发酵微生物群落在自然环境和人为调节双重影响下通过天然发酵形成的[1-3]。酵母菌是酱香型白酒酿造过程中的核心功能菌群,其中生香酵母对酸、醇有不同程度的酯化能力,生产代谢以酯香为主的多种风味化合物[4-6],是产生酒体芳香及促进酒体丰满的关键化合物,对酱香型白酒的风味感官有着举足轻重的作用。

长期生产经验及研究表明,温度是白酒发酵过程中的重要影响因素之一[7-8]。酵母菌是受温度影响较大的微生物,目前研究发现酵母菌的最适生长温度一般为28～30 ℃,而酱香型白酒的堆积发酵温度为25～50 ℃,堆积过程正是生香酵母大量富集的阶段,也是其代谢产生多种风味物质的关键时期,所以生香酵母会受到堆积发酵温度的影响,从而影响其香味物质的产生,进而影响白酒的口感风味。温度可通过影响酵母菌生长代谢及其一系列生化反应过程从而影响酒的产量及质量[9-10]。本实验使用前期从酱香大曲和酒醅中分离筛选得到的6株产香酵母,通过温度变化,探究温度对其生长代谢的影响,从而追溯产香酵母的分离筛选环境,了解其在对应生产环境下生长代谢的变化,以期为白酒机械智能化酿造提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本研究所用6株酵母是从这6个酵母种属中各选出其中1株酵母开展研究(表1),实验所用产香酵母均由本实验保藏。

表1 实验所用产香酵母明细

Table 1 Details of the aroma-producing yeast used in the experiment

酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基(yeast peptone dextrose medium，YPD固体培养基)：在100 mL蒸馏水中加入1 g酵母浸粉、2 g蛋白胨、2 g 葡萄糖、2 g 琼脂粉，115 ℃灭菌 20 min；酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(yeast peptone dextrose medium，YPD 液体培养基)：在100 mL蒸馏水中加入1 g 酵母浸粉、2 g 蛋白胨、2 g 葡萄糖，115 ℃灭菌 20 min。

SW-CJ-LFD超净工作台,苏州市金净净化设备科技有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅,上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BMJ-250B-Z恒温培养箱,上海博讯实业有限公司医疗设备厂；722S可见光分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司；7890A GC—5975C MSD气相色谱-质谱联用仪、DB-WAX毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm),美国Agilent公司；57348-U萃取头 二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)50/30 μm,美国SUPELCO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生长曲线测定

1.2.1.1 酵母活化

在YPDA固体培养基上分别挑取6株产香酵母,接种于100 mL YPD液体培养基中,于28 ℃、160 r/min条件下培养24 h制成种子液。

1.2.1.2 生长曲线测定

设置不同温度梯度为25、30、35、40 ℃,将各产香酵母种子液矫正OD680 nm=1.0,以1%的接种量接种于100 mL YPD液体培养基中,在25、30、35、40 ℃,4个温度梯度下进行培养,设置3组平行实验,以灭菌YPD液体培养基为对照。每隔2 h取2 mL菌液于比色皿中,使用可见光分光光度计于680 nm处测定菌悬液的OD680值,然后根据时间和OD680值绘制不同温度下各酵母的生长曲线。

1.2.2 挥发性风味物质测定

选取不同温度下各产香酵母稳定中期发酵液测3组平行,酵母菌发酵液的挥发性风味物质采用顶空固相微萃取-气质联用技术测定,香气物质使用配备有 PAL自动进样器的7890A/5975C气相色谱法质谱联用仪检测,选择DB-WAX毛细管色谱柱。将8 mL待测样品加入20 mL样品瓶中,同时加入2 g氯化钠和1 μL内标(2-辛醇,质量浓度 0.822 mg/mL),然后迅速拧紧瓶盖密封。在45 ℃恒温条件下,160 r/min平衡10 min。待瓶中的气-液相香气物质达到平衡后,将萃取头插入样品瓶的顶空部分,搅拌萃取45 min,使样品瓶中的香气物质达到气-固和气-液平衡。然后将萃取头插入气相色谱-质谱进样口,250 ℃热解吸10 min,采用不分流模式进样。恒流模式,柱流量0.8 mL/min,程序升温,初始温度40 ℃,以1 ℃/min 升到45 ℃,保持2 min,以3 ℃/min 升到84 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升到120 ℃,保持3 min,以3 ℃/min升到200 ℃,以5 ℃/min升到230 ℃,运行时间71.667 min,离子源温度为 230 ℃,电离方式为电子电离(electron ionization,EI),离子能源 70 eV,质量扫描范围为 20～350 u[11-12]。

1.2.3 挥发性风味物质分析

定性分析用GC-MS内置比色谱库NIST14检索匹配,选取匹配度>80%的物质,并结合标准品进行验证。用外标标准曲线法进行定量分析,将对应物质标准品进行浓度梯度稀释,外标物所在体系与待测样品在相同条件下平行地处理及检测运用,绘制挥发性物质的标准曲线。

2 结果与分析

2.1 不同温度下6株产香酵母生长状态分析

同样为酱香型酒醅和大曲中筛选得到的6株产香酵母,在不同温度下生长状态各不相同,温度对其生长发育影响很大,间接证明温度对产香酵母生长代谢的影响,影响了酱香型白酒香味物质的产生。FBKL2.0161和FBKL2.0130两株酵母在25和30 ℃下生长发育正常,在35和40 ℃下不能正常生长,所以图1-a和图1-b 35和40 ℃生长曲线重合；FBKL2.00K8,FBKL2.0162和FBKL2.0164三株酵母在25、30、35 ℃下都能正常生长,具有一定的高温耐受性,在40 ℃下不能生长；酵母FBKL2.0163在25、30、35、40 ℃下都能正常生长,说明该酵母为酱香型白酒中一株耐高温的产香酵母。

a-FBKL2.0161；b-FBKL2.0130；c-FBKL2.00K8；d-FBKL2.0162；e-FBKL2.0164；f-FBKL2.0163

图1 不同温度下6株产香酵母生长状态

Fig.1 Growth status of six aroma-producing yeasts at different temperatures

由图1-a和图1-b可知,在25、30 ℃下,FBKL 2.0161酵母在8 h进入对数生长期,在24 h进入稳定生长期。在这2个温度下该酵母生长趋势大致相似。FBKL 2.0130酵母在6 h进入对数生长期,在28 h进入稳定生长期。当达到35、40 ℃高温后,这2株酵母停止生长。由图1-c～图1-e可知,这3株酵母在25、30、35 ℃表现出良好的生长状态,但当到达40 ℃的高温后,这3株酵母均停止生长。FBKL2.00K8在6 h进入对数生长期,在18 h进入稳定期,在这3个温度下生长趋势大致相似。在25、30 ℃下,FBKL 2.0162酵母在10 h进入对数生长期,在28 h进入稳定期,在25、30 ℃下生长趋势大致相同,但在35 ℃下进入稳定期的时长是25、30 ℃的1倍左右,有研究表明当温度高于一定值后,酵母菌的热死亡会成为影响比增长速率的因素之一[13],这与该酵母在35 ℃下的生长状态表现一致,该酵母可能在35 ℃时发生细胞热死亡。FBKL2.0164酵母的生长速率由快到慢为35、30、25 ℃,由此可知该酵母在35 ℃下生长速率最快,更早到达稳定期,随着温度升高,该酵母生长发育更为旺盛。由图1-f可知该酵母在4个温度梯度下生长状态良好,在4 h进入对数生长期,进入对数生长期时间短,在8 h左右到达稳定期,生长速率快。该酵母是好氧酵母,在溶氧充足的环境中,生长迅速,在35～40 ℃条件下,其发酵效率比酿酒酵母更高[14]。

2.2 相同温度下6株产香酵母生长状态分析

如图2-a所示,在25 ℃下,6株酵母生长状态良好,生长速率为FBKL2.0163>FBKL2.00K8>FBKL2.0130>FBKL2.0161>FBKL2.0162>FBKL 2.0164,FBKL2.0163酵母在25 ℃下生长速率最快,在较短时间内获得高密度,高活力细胞,适应性最强,FBKL2.0164酵母在25 ℃下生长速率最慢,进入稳定期时间最长,在稳定期的OD680低于其他菌株,而FBKL2.0130在稳定期的OD680高于其他菌株。如图2-b所示,在30 ℃下,6株酵母生长状态良好,生长速率为FBKL2.0163>FBKL2.00K8>FBKL2.0164>FBKL2.0161>FBKL2.0162>FBKL2.0130,FBKL 2.00K8在稳定期的OD680高于其他菌株,FBKL2.0164在稳定期的OD680最低。如图2-c所示,在35 ℃下,FBKL2.0130和FBKL2.0161酵母不生长,在发酵过程中,高温会使蛋白质变性,也会引起质膜流动性的变化,如高温使磷脂分子在膜内作快速的侧向扩散,使膜脂的流动性增加,破坏膜的完整性,从而导致细胞的存活力迅速下降,生长速率降低或停止生长[15-16]。在35 ℃下仅4株酵母生长状态良好,能适应高温环境,其生长速率为FBKL2.0163>FBKL2.0164>FBKL2.00K8>FBKL2.0162,FBKL2.0163酵母在35 ℃下生长速率最快,最能适应高温环境,FBKL2.0162酵母在35 ℃下生长速率最慢,稳定期的OD680最低,FBKL2.00K8在稳定期的OD680最高。如图2-d所示,在40 ℃下,仅FBKL2.0163酵母能够正常生长,能够适应高温环境,由此可以看出FBKL2.0163在4个温度梯度下的生长速率都高于其他5株酵母,对高温的适应性最强。

a-25 ℃；b-30 ℃；c-35 ℃；d-40 ℃

图2 相同温度下6株产香酵母生长状态对比

Fig.2 Growth status of six aroma-producing yeasts under same temperature

2.3 不同温度下6株产香酵母挥发性风味物质成分变化和热图分析

2.3.1 不同种属酵母菌株代谢产物的差异

由表2～表4和图3可知,6株不同种属的酵母菌株的代谢产物有显著差异,在6株酵母中FBKL 2.00K8酵母产酯能力最强,与其他5株酵母产酯量相比有显著差异,其中酯类物质中乙酸乙酯产量最多,有研究表明[17],该类酵母为高产乙酸乙酯的酵母。乙酸乙酯是白酒中重要的风味化合物,是白酒中水果香的主要来源。FBKL2.0130,FBKL2.0161,FBKL 2.0162,FBKL2.0163和BKL2.0164酵母都有较强的产醇能力,主要产生以异戊醇为主的醇类物质,醇类是白酒的醇甜和助香剂的重要来源,也是酯类的前驱物质,它们可以增加酒体的甜度和醇厚感[1]。

图3 六株产香酵母不同温度下挥发性物质热图

Fig.3 Heat map of volatile substances of six aroma producing yeasts at different temperatures

其中FBKL2.0161的产醇能力最强,并且还产生最多的3-羟基-2-丁酮,该物质作为合成四甲基吡嗪的重要前体物,可与微生物酶分解原料中蛋白质和氨基酸产生的氨发生非酶促反应合成四甲基吡嗪[18]；FBKL2.0130还有最强的产酸能力,其代谢产生以乙酸为主的酸类物质,其产酸能力与其他5株酵母有显著差异；FBKL2.0163和FBKL2.0162酵母还产生较多的乙基酯类物质,包括己酸乙酯(水果)、辛酸乙酯(橙子)、癸酸乙酯(水果)等[19]；FBKL2.0164还产生较多吡嗪类物质,为酒体提供烘焙、坚果、可可等香气。

2.3.2 温度对酵母菌株代谢产物的影响

由表2和图3可知,温度对FBKL2.130酵母产酸和产醇的能力有显著影响,在25 ℃下产酸和产醇含量最高,为30 ℃的2倍和3倍,在25 ℃下产醇显著较高的是异丁醇,异戊醇,2,3-丁二醇,产酸显著较高的是乙酸,异丁酸和丁酸。在30 ℃下酸类物质和醇类物质含量明显降低。白酒中的高级醇主要通过2个途径生成：氨基酸降解代谢路径(Ehrlich代谢机制)和糖合成代谢路径(Harris代谢机制)[20-21]。温度升高,可能对高级醇代谢路径上的酶产生影响,从而影响了高级醇的合成。

由表2和图3可知,FBKL2.00K8在不同温度下代谢产生大量以乙酸乙酯为主的酯类物质为酒体带来了水果香。有研究表明[17],该类酵母为高产乙酸乙酯的酵母,与本研究结果一致。温度对FBKL 2.00K8酵母的产酯能力有显著影响,特别是对该酵母产乙酸乙酯的能力影响显著。在25 ℃下乙酸乙酯的产量是30、35 ℃的2倍。在25 ℃下乙酸乙酯和苯乙醇的产量显著高于30、35 ℃。醇乙酰基转移酶是负责乙酸乙酯等乙酸酯类合成的关键酶,通过催化乙酰辅酶A和乙醇、异丁醇、异戊醇等醇类生成乙酸酯类物质[22-25]。该酵母在25 ℃下产生大量乙酸乙酯,可能是因为在25 ℃下醇乙酰基转移酶活跃,使该酵母催化产生较多乙酸酯类物质,随着温度的升高,该酵母产酯能力有所下降,可能是高温使酶变性失活,醇乙酰基转移酶活性降低,乙酸酯类物质含量逐渐减少。

表2 不同温度下FBKL2.0130和FBKL2.00K8酵母挥发性风味物质的成分和含量 单位：μg/mL

Table 2 Composition and content of volatile flavor compounds of FBKL2.0130 and FBKL2.00K8 yeast at different temperatures

续表2

注：同种挥发性产物肩标不同小写字母表示差异显著,P<0.05;“-”未检出(下同)

由表3和图3可知,温度对FBKL2.0161酵母的产醇和产酮能力有显著影响,该酵母在25 ℃下产生大量醇类物质,其含量与30 ℃有显著差异,在25 ℃下醇类含量有显著差异的是异丁醇、异戊醇和苯甲醇。该酵母在30 ℃下代谢产生了2,3-丁二醇和3-羟基-2-丁酮2种独特的物质。有研究表明[26],3-羟基-2-丁酮在2,3-丁二醇还原酶作用下生成2,3-丁二醇,在一定条件下3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇可相互转化,其在30 ℃下3-羟基-2-丁酮的含量显著上升。

由表3和图3可知,温度对FBKL2.0162酵母产醇和产乙基酯的能力有显著影响。该酵母在25 ℃下代谢产生以苯乙醇、异戊醇、异丁醇、2-庚醇、2-壬醇、甲基异丁甲醇为主的醇类物质,其醇类物质含量是30、35 ℃的4和14倍。在30、35 ℃则主要代谢产生丁酸乙酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯等乙基酯类物质,其含量与25 ℃有显著差异。

表3 不同温度下FBKL2.0161和FBKL2.0162酵母挥发性风味物质的成分和含量 单位：μg/mL

Table 3 Composition and content of volatile flavor compounds of FBKL2.0161 and FBKL2.0162 yeast at different temperatures

续表3

由表4和图3可知,FBKL2.0163酵母在25、30、35、40 ℃下生长状态良好,为一株耐高温产香酵母。在不同温度下代谢产生大量风味物质,为酒体增加丰富的花香和果香[27]。但温度对其产醇和产乙基酯的能力有显著影响。该酵母在25 ℃下代谢产生己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯等具有丰富果香和花香的乙基酯类物质,并代谢产生异戊醇为主的醇类物质。随着温度的升高,乙基酯类物质和醇类物质的产量逐渐降低。

由表4和图3可知,FBKL2.0164酵母对传统白酒发酵过程中的风味相关代谢物的产生非常重要[28]。温度对其产醇能力和产吡嗪能力有显著影响。其在25 ℃下生产代谢以异戊醇和苯甲醇为主的醇类物质,随着温度的升高,苯甲醇的含量逐渐减少,异戊醇的含量为零。而2,3-丁二醇,2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪的含量明显增多,在35 ℃时达到最大值,表明高温有利于2,3-丁二醇和吡嗪类物质的产生。

表4 不同温度下FBKL2.0163和FBKL2.0164酵母挥发性风味物质的成分和含量 单位：μg/mL

Table 4 Composition and content of volatile flavor compounds of FBKL2.0163 and FBKL2.0164 yeast at different temperatures

续表4

3 结论

本实验通过对25、30、35、40 ℃温度梯度下,从酱香大曲和堆积酒醅中分离得到的6株产香酵母的生长代谢进行比较分析,发现在不同温度下,不同产香酵母的生长能力和发酵产生香气的能力有显著差别。FBKL2.0130和FBKL2.0161酵母适应25～30 ℃的常温发酵,产酸和产醇能力最强；FBKL2.00K8具有良好的产乙酸酯的能力,能增加白酒的水果香气；FBKL2.0162和FBKL2.0163能产生较多乙基酯类物质,赋予白酒树木果实的香气。并且FBKL2.0163能在40 ℃的高温下生长并产生多种挥发性物质,FBKL2.0164在35 ℃下产生较多吡嗪类物质,为白酒提供坚果香气。总体来说,6株生香酵母在25 ℃下都表现出良好的产挥发性风味物质的能力,其挥发性物质的含量明显高于其他温度梯度,分别为FBKL2.0130(7 090.268 μg/mL)、FBKL2.00K8(2 613.965 μg/mL)、FBKL2.0161(1 289.469 μg/mL)、FBKL2.0162(1 042.398 μg/mL)、FBKL2.0163(1 344.781 μg/mL)和FBKL2.0164(1 367.180 μg/mL)。随着温度的升高,每株酵母表现出不同的生长代谢能力。本文探究了温度对酱香白酒中产香酵母生长代谢的影响,以期为白酒机械化智能酿造工艺提供一定的理论基础。